骨骼肌特异性报告基因逆转录病毒载体的构建与验证

摘要

目的：卫星细胞(muscle satellite cells)认为是保留在成年骨骼肌内具有增殖分化能力的肌源性细胞。建立简便快速的鉴定和筛选骨骼肌卫星细胞的方法对于卫星细胞培养、研究和应用都具有实际的意义。Desmin是目前知道的表达开始于骨骼肌卫星细胞并在肌纤维中高表达的标志蛋白。因此以Desmin基因的启动子元件控制的报告基因可望建立鉴定和筛选骨骼肌卫星细胞的简便方法。本课题目的是构建逆转录病毒报告基因载体，特异性表达于骨骼肌细胞中，并通过检测其绿色荧光蛋白表达，验证其在骨骼肌细胞中表达的特异性。并在此基础上将本实验所构建重组载体制备成逆转录病毒悬液，检测其在分化的P 19细胞中的表达。 方法：(1)重组载体的构建与鉴定，首先用PCR法扩增所需要的目的片段，绿色荧光蛋白和新霉素基因(GFP+NEO)和desmin启动子和增强子(pro+enh)，然后利用限制性内切酶和T4 DNA连接酶，将目的基因连接到经Nco Ⅰ，BamH Ⅰ，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切后回收的逆转录病毒载体psuper线性片段上。(2)重组载体的骨骼肌卫星细胞表达特异性验证：将psuper和重组载体分别转染CHO和C2C12细胞，24h后，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，采集图片。(3)逆转录病毒悬液制备及其在分化P19细胞中的应用，逆转录病毒悬液转染C2C12和DMSO诱导分化的P19细胞，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，采集图片。 结果：(1)通过对构建过程的每一步进行电泳分析，证明了所构建重组载体是正确的。(2)重组载体和psuper转染CHO和C2C12细胞后，在C2C12细胞表达水平相当，说明重组载体在C2C12中能够表达，而在CHO细胞中重组载体看不到表达，psuper则具有很高的表达。这就说明了重组载体具有骨骼肌卫星细胞表达特异性。(3)制备的逆转录病毒悬液转染C2C12后，绿色荧光表达效率有所提高但是并不非常明显。在转染了诱导分化的P19细胞中，发现了绿色荧光蛋白的表达，据此可以定性判断DMSO诱导P19细胞分化为骨骼肌细胞。 结论：通过电泳分析方法鉴定了所构建载体是正确的，另外在转染CHO和C2C12细胞的特异性验证过程中，通过绿色荧光蛋白表达结果分析说明了所构建载体具有骨骼肌卫星细胞特异性。这为骨骼肌细胞的纯化提供了基础，也为骨骼肌卫星细胞用于组织工程和基因治疗提供了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1骨骼肌卫星细胞概述

1.1.1概念

1.1.2卫星细胞的起源

1.1.3成肌细胞的发育

1.1.4成肌细胞的体外培养及其存在问题

1.1.5骨骼肌卫星细胞的分化与鉴定

1.1.6卫星细胞的识别

1.1.7研究进展及研究意义

1.2报告基因

1.2.1报告基因的研究背景

1.2.2报告基因的类型及特点

1.2.3报告基因的应用

1.2.4展望

1.3本实验重组载体构建的原理

2材料和方法

2.1材料

2.1.1质粒、细胞与菌种

2.1.2主要试剂

2.1.3培养基与溶液

2.1.4主要仪器

2.2实验方法

2.2.1细胞培养

2.2.2质粒的扩增与提取

2.2.3质粒的构建与鉴定

2.2.4通过转染方法验证质粒表达特异性

2.2.5逆转录病毒悬液的制备及其在分化P19中的应用

3结果

3.1重组质粒的构建与鉴定

3.1.1 PCR扩增所得目的片段的鉴定

3.1.2载体的构建与鉴定

3.2重组载体表达特异性验证

3.2.1 pSRS-gfp-neo-pD-eD和psuper在C2C12中的表达

3.2.2 pSRS-gfp-neo-pD-eD和psuper在CHO中的表达

3.3逆转录病毒悬液的制备及其在分化P19细胞中的应用

3.3.1逆转录病毒悬液感染力的测定

3.3.2逆转录病毒悬液转染P19细胞

4讨论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢