苦瓜抑菌活性成分的提取分离与抑菌作用研究

摘要

苦瓜富含蛋白质、糖、维生素及各种必需氨基酸等。苦瓜不仅有良好的食用价值，而且还有明显的药用功能，素有“药用蔬菜”之称。本文通过超声波辅助提取苦瓜中抑菌活性成分的粗产品，以抑菌效果（抑菌圈直径）来评价其抑菌作用；同时在抑菌活性的跟踪下，分析抑菌活性成分的提取分离条件以及优化工艺参数，并且进一步分离鉴定苦瓜中主要的抑菌活性成分，最后对其进行抑菌作用研究，为苦瓜资源在食品抑菌领域的开发利用提供理论依据和技术支持。
　　 在本课题的研究中，首先，在对料液比、超声时间、乙醇浓度、超声功率等四个单因素试验的基础上，采用四因素三水平的响应面法对各因素显著性和交互作用进行分析，最后得出超声波辅助提取苦瓜抑菌活性成分的最佳工艺条件为：超声功率320w、超声波处理时间60min、料液比（苦瓜粉：乙醇）1:20、抑菌活性成分（乙醇）浓度70％，抑菌圈直径达到12.8mm。
　　 其次，依次采用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇以及水对苦瓜抑菌活性成分进行分部提取，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，以抑菌效果（抑菌圈直径）为评价指标，记录各极性部位溶液的抑菌圈直径。得到试验结果显示：苦瓜抑菌活性成分的二氯甲烷部活性成分抑菌效果最佳，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为16.0mm和12.0mm，说明苦瓜中的抑菌活性成分以中、弱极性的物质为主。
　　 再者，试验中选择200～300目硅胶为柱填料，以抑菌效果为评价指标，利用制备型高效液相法（Pre-HPLC）对苦瓜抑菌活性成分中的抑菌活性成分进行分离制备。试验结果表明：当流动相配比石油醚（60-90℃）：乙酸乙酯为7:3，进样量50μL，流速5mL/min时，检测器在280nm波长处所检测到的物质抑菌效果最好，其对大肠杆菌的抑菌效果最为明显，抑菌圈直径为12.0mm，对照组没有抑菌效果。
　　 另外，本文中采用定性和定量的分析方法对苦瓜中抑菌活性成分进行检测，得到结果显示：在苦瓜抑菌活性成分中含有黄酮类、生物碱、有机酸和皂甙等四种成分，而不含有蒽醌及其甙类和酚类等成分。采用紫外-可见分光光度法对其中的主要成分-黄酮类和皂苷类物质进行含量检测，得到二者的含量分别为31.61％和6.25％。进一步用气质联用（GC-MS）对其进行分析，得到苦瓜抑菌活性成分中含有10种挥发性成分。这10种成分中主要都为亲脂性物质，其中主要以芥酸酰胺和十二甲基环己烷为主，利用峰面积归一化法对各挥发性成分的相对含量进行计算，得到其相对含量分别占到38.83％与8.53％。
　　 同时，本文以抑菌效果为评价指标，采用革兰氏阳性菌和阴性菌中最具代表性的菌种（大肠杆菌、枯草杆菌、产气肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉和米曲霉）作为指示菌，以此研究苦瓜粗提液中抑菌活性成分的抑菌谱及其相关的稳定性。试验结果表明：苦瓜粗提液对细菌有较强的抑制作用，其中，苦瓜抑菌活性成分对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）低达18.75 mg/mL，而其对枯草杆菌的MIC更是低达9.38 mg/mL。但其对霉菌和酵母菌没有明显抑制作用。在同等浓度下，苦瓜抑菌活性成分对细菌的抑制作用强于山梨酸钾。同时，本文也证明该抑菌活性成分在一定范围的温度、pH环境、紫外光照射时间和无机盐浓度的条件下仍然能保持较好的抑菌活性。
　　 在后续的研究中，本文又通过对苦瓜抑菌活性成分与山梨酸钾单独作用以及二者混合作用于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、产气肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉和米曲霉，研究上述三种待测液对这些指示菌的抑制效果，从上述试验可以得出结论：苦瓜抑菌活性成分在较低浓度时对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及产期肠杆菌有较好的抑制效果，但对金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉和米曲霉没有抑制效果。另外还得到适合用于抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和产气肠杆菌这三种指示菌的混合抑菌液以苦瓜抑菌活性成分与山梨酸钾混合比例达到7:3为宜；适合于金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉和米曲霉于这四种指示菌的混合抑菌液以苦瓜抑菌活性成分与山梨酸钾混合比例达到3:7为宜。
　　 最后，对苦瓜抑菌活性成分浸膏相关微生物检测，得到结论如下：苦瓜抑菌活性成分中的细菌总数为32 CFU/mL；大肠杆菌和霉菌数为0CFU/mL。同时，本文通过对苦瓜抑菌活性成分对市售新鲜猪肉、新鲜果汁以及新鲜蔬菜汁的防腐保鲜研究，得到的结果显示：随着存放时间的延长，虽然新鲜猪肉中的细菌总数呈现逐渐上升趋势，但在整个存放时间内，即使是在长达12天的存放时间内，新鲜猪肉中的细菌总数（2.2×105 CFU/g），新鲜橙子汁中的细菌总数（1.9×104 CFU/g），新鲜蔬菜汁中的细菌总数（2.2×104 CFU/g），都处于国家规定的标准范围之内。