川贝母有效成分提取及其生物碱合成途径基因HMGR片段克隆的研究

摘要

川贝母为百合科Liliaceae贝母属Fritillaria L．多种植物的干燥鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳之功效，是四川最重要的道地药材之一，其有效成分主要为生物碱类和皂苷类。
　　 本实验首先采用正交试验方法分别优化了川贝母有效成分生物碱和皂苷的提取工艺，然后运用最佳提取工艺分别考察了8种不同品种、产地贝母的有效成分含量，实验结果为川贝母的工业化提取和品种选育提供了理论依据。
　　 运用氨水碱化、乙醚沉淀法提取贝母总生物碱。以川贝母植物基源之一的暗紫贝母(Fritillaria unibracteata Kisao et K.C.Hisa)为试材，选取了提取时间、料液比、提取次数三因素，通过正交实验确定了川贝母的总生物碱最佳提取工艺，结果显示最佳提取条件为为：时间36小时、料液比40mL、提取次数2次，实际操作提取次数1次。在所得优化工艺条件下测定了8种不同品种、产地贝母中总生物碱的含量，结果表明川贝母中总生物碱的含量明显低于其它品种贝母，相同品种不同产地贝母的总生物碱的含量也有差别。
　　 采用甲醇索氏法、乙醚沉淀法提取贝母总皂苷。以暗紫贝母为试材，选取了药材粒度、提取时间、甲醇浓度三个因素，通过正交实验确定了川贝母中总皂苷的最佳提取工艺，得到最佳提取条件为：提取时间8小时、粒度100目、甲醇为分析纯。在所得优化工艺条件下测定了8种不同品种、产地贝母中总皂苷的含量，所得结果表明川贝母中总皂苷的含量高于伊贝母、浙贝母及平贝母，而相同品种、不同产地的贝母中总皂苷的含量也有一定差别。
　　 本实验还对川贝母有效成分甾体类生物碱和皂苷生物合成公共途径中的关键酶基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase,HMGR)片段进行了克隆。由于川贝母鳞茎富含油脂、多糖和多酚类成分，常用的植物总RNA提取方法不适用于川贝母的总RNA提取，因此本实验以暗紫贝母新鲜鳞茎为试材，选取3种有效提取富含油脂、多糖和酚类植物材料总RNA的方法，比较提取总RNA的效果。结果表明，改良SDS酸酚法能有效去除大部分多糖和DNA,RNA条带清晰、亮度好，28SrRNA的亮度约为18SrRNA的2倍，A260nm/A280nm为1.85,A260nm/A230nm为2.06，得率为73μg/g。实验采用改良SDS酸酚法提取川贝母总RNA，设计特异性引物，经RT-PCR得到了约300bp长度的惟一扩增片段，该结果符合引物设计推断的片段大小。HMGR基因片段的获得为该基因全长序列的克隆、功能及川贝母有效成分生物合成的研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

1.1 川贝母的资源学研究

1.2 川贝母的主要化学成分

1.2.1 生物碱类成分

1.2.2 皂苷类成分

1.2.3 其他成分

1.3 生物学研究

1.3.1 生物合成途径研究

1.3.2 HMGR基因

2 川贝母总生物碱的提取与测定

2.1 研究的目的和意义

2.1.1 目的

2.1.2 意义

2.2 生物碱的含量测定方法

2.2.1 滴定法

2.2.2 分光光度法

2.2.3 薄层扫描法

2.2.4 高效液相色谱法

2.2.5 气相色谱法

2.2.6 毛细管电泳法

2.3 材料与方法

2.3.1 药材

2.3.2 仪器

2.3.3 试剂

2.3.4 实验条件的选择

2.3.5 实验方法

2.4 实验结果与分析

2.4.1 贝母中总生物碱的提取工艺优化

2.4.2 贝母含量测定

2.4.3 稳定性实验和加样回收率

2.4.4 分析

2.5 结论

3 川贝母总皂苷的提取与测定

3.1 研究的目的和意义

3.1.1 目的

3.1.2 意义

3.2 总皂苷的含量测定方法

3.2.1 重量法

3.2.2 溴量法

3.2.3 比色法

3.2.4 紫外分光光度法

3.2.5 薄层扫描法

3.2.6 高效液相色谱法

3.2.7 气相-质谱法

3.3 贝母中皂苷提取工艺的优化

3.3.1 药材、仪器与试剂

3.3.2 实验方法与过程

3.3.3 正交试验分析

3.3.4 结论

3.4 不同贝母总皂苷含量测定

3.4.1 药材、仪器与试剂

3.4.2 样品处理方法

3.4.3 结果与分析

3.5 结论

4 川贝母总RNA提取方法研究及HMGR基因的克隆

4.1 研究的目的和意义

4.1.1 目的

4.1.2 研究的重要意义

4.2 总RNA提取方法优化

4.2.1 实验准备

4.2.2 RNA提取

4.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测

4.2.4 蛋白核酸测定仪检测

4.2.5 讨论

4.3 RT-PCR

4.3.1 引物设计

4.3.2 反转录

4.3.3 PCR扩增

4.3.4 实验结果

4.3.5 片段分析

4.3.6 讨论

4.4 结论

全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间学术论文及科研情况

致谢