山葵墨入病菌（Phoma wasabiae）生物学特性研究及遗传多样性分析

摘要

山葵(Eutrema Wasabia Maxim)为十字花科辣根属多年生草本植物.它是中国近几年从台湾、日本等地引进的一种香辛料作物,具有香、辛、甘及粘等独特的风味珍稀蔬菜.在台湾、日本、泰国、韩国等地受到当地居民的青睐.中国四川的优越气候资源和丰富的劳动力资源,适合大面积种植和发展山葵,但经调查发现目前四川山葵种植业受到山葵墨入病等一些病害的严重威胁.这种病害不仅影响山葵的产量和质量,造成很大的经济损失,而且影响山葵的种植和可持续发展.为此我们对四川都江堰、乐山、什邡、邛崃、崇州等市(县)山葵种植基地的山葵墨入病危害情况进行了田间调查,并采集带病植株进行室内分离鉴定.结果表明山葵墨入病是危害山葵的最为严重的病害,病株率可达90.00﹪~100﹪,病叶率达28.13﹪~78.99﹪.发病后,在山葵叶片上产生黑色病斑,茎干内部变黑腐败,严重时整个植株腐烂倒伏.我们从山葵墨入病病株中分离出了山葵茎点霉菌Phoma wasabiae Yokogi.对其生物学特性研究结果表明,PDA培养基为该菌生长的最佳培养基:不同的温度、pH值、光照等条件对该菌的菌丝生长和产孢有明显的影响.适宜该菌的生长温度范围为19~25℃,最适温度为22℃;适宜该菌生长的pH在5.0~7.5之间,最适在弱酸性、中性和弱碱性条件下生长;该菌在黑暗条件下比在一直光照和光暗交替处理下都生长快,而且产孢能力相对较强.该病原菌致死温度为54 ℃(10min),孢子的致死温度为49℃(10min).该病菌有较强的寄主专化性.在对四川境内山葵墨入病害进行广泛调查和病原采样收集的基础上,我们利用RAPD分子标记技术分析了四川山葵种植区域内山葵墨入病菌的遗传多样性,揭示了该菌的遗传分化等特性,为进一步研究山葵墨入病菌鉴定和山葵墨入病抗病育种、病害预测及防治提供了依据.我们用改进的氯化苄法获得了供试菌株DNA.从40个10-碱基的寡聚核苷酸随机引物中选用了6个作为引物,对25个P.wasabiae Yokogi和3个近似菌Macrophoma sp.菌株的DNA进行PCR扩增,应用凝胶图谱分析软件分析了25个P.wasabiae Yokogi和3个近似菌Macrophoma sp.菌株的DNA指纹特征,并对不同的随机引物的扩增结果进行了聚类分析.

目录

1.前言

2.材料与方法

2.1山葵墨入病田间危害情况调查

2.2室内分离与鉴定

2.3菌种纯化

2.4山葵墨入病菌生物学特性

2.4.1山葵墨入病菌分生孢子萌发

2.4.2培养基的优选

2.4.3温度对山葵墨入病菌菌丝生长的影响

2.4.4 pH对山葵墨入病菌菌丝生长的影响

2.4.5光照对菌丝体生长和产孢的影响

2.4.6山葵墨入病菌菌丝和孢子致死温度的测定

2.5盆栽试验

2.6山葵墨入病菌的RAPD分析

2.6.1供试菌株

2.6.2供试菌株培养收集方法

2.6.3 DNA的提取

2.6.4引物的选择

2.6.5 PCR扩增

2.6.6电泳检测

2.6.7凝胶成像

2.6.8图谱聚类分析

2.6.9重复试验

3.结果与分析

3.1山葵墨入病田间危害情况

3.2室内分离与鉴定

3.3山葵墨入病菌的生物学特性

3.3.1 Phoma wasabiae Yokogi分生孢子萌发

3.3.2培养基选择

3.3.3温度对病原菌菌丝生长的影响

3.3.4pH值对病原菌菌丝生长的影响

3.3.5光照与菌丝体生长和产孢的关系

3.3.6致死温度的测定

3.4盆栽试验

3.5山葵墨入病菌的RAPD分析

3.5.1供试菌株DNA的提取

3.5.2引物的筛选

3.5.3 PCR扩增结果

3.5.4图谱聚类分析

3.5.6特征性片段

4.讨论

4.1山葵墨入病的防治

4.2山葵墨入病菌的生物学特性与寄主的生态习性的关系

4.3山葵墨入病菌的寄主专化性和侵入途径

4.4山葵墨入病菌的遗传多样性与致病性的关系

4.5真菌DNA提取和纯化

4.6引物的筛选

4.7影响RAPD图谱重复性的因素

4.8检测和鉴别山葵墨入病菌的可行性和必要性

4.9 RAPD技术在研究植物病原真菌群体遗传、种内遗传分化中的作用

参考文献

附表

致谢

附：攻读硕士学位期间撰写及发表的文章