SARS-CoV X2蛋白亚细胞定位及其诱导细胞凋亡的研究

摘要

2002年底，在我国南方发现了一种新型的传染性严重急性呼吸系统综合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)，并波及众多国家和地区，引起广泛关注。随后经过各国研究者通力合作，很快确证了一种新的冠状病毒为导致该疾病的病原体，并命名为SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)。紧接着完成了SARS-CoV的基因组测序，并通过多种途径分析了其基因组结构特征。据预测，SARS-CoV的基因组有14个潜在的编码蛋白大于40个氨基酸的开放阅读框架(ORF)，包括复制相关蛋白酶基因和四个主要的结构蛋白(S、M、N、E)基因，以及几个与其它已知蛋白无明显同源性的未知蛋白的编码基因。未知蛋白X2由ORF4编码，共154个氨基酸，与其它已知蛋白没有明显的同源性。本研究把X2基因插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1、pEGFP-C1和载体pCMV-myc，构建重组质粒，转染293、COS-7和VERO细胞，通过细胞荧光和免疫荧光观察发现，X2蛋白定位于细胞核，并且呈点状聚集；进一步与核仁蛋白C23共定位，发现X2蛋白定位于核仁，且在不同细胞中，X2蛋白的定位状态表现一致。通过构建一系列X2蛋白缺失突变体与EGFP融合表达载体，在转染细胞内进行与C23的共定位，发现X2的核仁定位信号位于C端的134-154位氨基酸残基，这与用生物信息学方法分析的结果一致。采用流式细胞仪分析，发现X2蛋白的表达能引起Vero、293和COS-7细胞出现G0/G1期阻滞，并且能够诱导COS-7细胞发生凋亡。这些结果为进一步研究X2蛋白在SARS-CoV的复制、感染和致病方面的作用提供了有用的参考信息。

目录

文摘

英文文摘

论文独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一部分文献综述

1.1.冠状病毒概述

1.2.SARS相关冠状病毒研究进展

1.2.1 SARS-CoV的病原学研究

1.2.2 SARS-CoV基因组结构及其预测编码蛋白

1.2.3 SARS-CoV基因组的变异性比较

1.2.4 SARS-CoY的系统发生学分析

1.2.5 SARS-CoY的来源

1.2.6 SARS的病理特征及其引起的机体免疫反应

1.2.7 SARS-CoY基因组编码蛋白研究进展

1.3本研究的目的和意义

第二部分材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种与细胞

2.1.2载体与cDNA

2.1.3生化试剂

2.1.4培养基和缓冲液

2.1.5仪器设备

2.2实验方法

2.2.1 SARS-CoY X2基因的克隆

2.2.2 SARS-CoY X2基因真核表达载体的构建

2.2.3 X2基因系列缺失突变体的构建

2.2.4重组X2蛋白在转染细胞中的表达

2.2.5重组x2蛋白在转染细胞中的定位

2.2.6 X2蛋白系列缺失突变体与核仁蛋白C23的共定位

2.2.7PI染色流式细胞仪检测SARS-CoVX2蛋白对293细胞周期的影响

2.2.8 SARS-CoV X2蛋白的表达诱导COS-7细胞发生凋亡

第三部分结果与分析

3.1 SARS-CoV X2蛋白的结构分析

3.2 SARS-CoV X2基因的克隆及其真核表达载体的构建

3.3 X2基因系列缺失突变体的构建

3.4 SARS-CoV X2蛋白在转染细胞中的表达

3.5 SARS-CoY X2蛋白在转染细胞中的定位

3.6 SARS-CoY X2蛋白在转染细胞中不同时间点的定位情况

3.7 SARS-CoV X2蛋白与核仁蛋白C23的共定位

3.8 X2基因核仁定位信号的检测

3.9 X2蛋白的表达引起细胞周期阻滞和凋亡的发生

第四部分讨论

4.1蛋白质的核仁定位

4.2核仁定位蛋白的功能

4.2.1细胞周期调控

4.2.2细胞凋亡

第五部分结论

参考文献

致谢