四个品种初生雏鸡腿肌差异表达序列标签（ESTs）的筛选及表达分析

摘要

本研究利用DDRT-PCR，比较了初生丝羽乌骨鸡(SK)、常羽乌骨鸡(NP)，爱拨益加(AA)肉鸡和尼克(NK)蛋鸡腿肌组织的基因表达的差异。　　本实验采用3个26bp的T7(dT11)N为锚定引物，24个26bp的M13-ARPs为随机引物，组成72个引物组合对上述四个品种雏鸡腿肌组织进行DDRT-PCR反应。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法分离差异片段，共获得214个差异片段，经重扩增和纯化后得到101个条带。利用单链构象多态性(SSCP)技术验证差异显示片段重扩增纯化产物的单一性，共得到87条单一片段。通过基因芯片杂交技术对获得的差异显示cDNA片段真实性进行鉴定，得到6条真实表达的差异条带，仅5条测序成功。　　分析与表达序列标签同源的已知功能的差异表达基因表明：已知功能的差异表达基因可能与初生雏鸡腿肌的生长发育、分化以及色素沉积有一定关系。COXⅢ基因在丝羽乌骨鸡和尼克蛋鸡中特异表达，而在山地乌骨鸡和AA肉鸡未表达，暗示COXⅢ基因的差异表达与腿肌在初生阶段的生长发育中有关。M-CK基因在AA肉鸡中特异表达，而在其余三种鸡中不表达，推测M-CK基因在促进初生雏鸡腿肌的发育和分化中起着重要调控作用。14-3-3ε基因在SK中不表达，在NP、AA肉鸡、NK蛋鸡中特异表达，推测14-3-3ε的表达可能在鸡的初生阶段腿肌黑色素的合成或运输中起着重要的调控作用。　　COXⅢ和M-CK基因在能量代谢、肌肉的生成中起着重要的作用，可见四个品种的初生雏鸡腿肌在生长发育上的显著差异，可能与这两个基因的差异表达有关。乌骨鸡的黑色素的合成和运输是一个非常复杂的过程，有众多的基因参与和调控，如何找到控制黑色素形成的主效基因和弄清其表达调控机理还有待更多的研究。14-3-3ε基因在黑色素形成中的作用为理解其调控机制提供了重要的信息。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：常用词语缩写

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第一章文献综述

1.乌骨鸡特异性状的研究

1.1乌骨鸡肉质的研究

1.2乌骨鸡的黑色素的研究

2.基因表达差异的研究方法

2.1差异显示PCR技术原理

2.2差异显示技术的引物设计

2.3差异显示中真假阳性基因的鉴定

3.表达序列标签的研究及应用

3.1表达序列标签（ESTs）的研究及应用

3.2畜禽表达序列标签的研究概况

4.本实验的研究思路及意义

第二章四种不同品种鸡腿肌差异表达cDNA片段的筛选

1.实验材料

1.1参试鸡种及主要特征

1.2样品采集与处理

1.3差异显示引物

1.4主要试剂及试剂盒

2.实验方法

2.1总RNA抽提

2.2 RNA质量和浓度检测

2.3各品种腿肌总RNA池制备

2.4 DNase I处理

2.5差异显示逆转录PCR(DDRT-PCR)

2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

2.7差异片段的切取与再扩增

3.实验结果

3.1腿肌组织总RNA的提取结果

3.2差异显示逆转录PCR产物的电泳结果

3.3差异片段的切取

3.4差异片段的再扩增与纯化

4.讨论与分析

4.1总RNA的抽提

4.2关于DNase I处理

4.3反应条件对实验结果的影响

4.4差异条带的回收

4.5差异条带再扩增

第三章差异表达cDNA片段真实性的验证

1.材料与方法

1.1实验材料

1.2主要试剂及试剂盒

2.实验方法

2.1单链构象多态性(SSCP)分析差异条带单一性

2.2利用基因芯片进行杂交验证

3.实验结果

3.1 SSCP筛选结果

3.2基因芯片杂交结果

4.讨论与分析

4.1 SSCP的特点

4.2基因芯片杂交验证差异条带的真实性

第四章四个品种鸡腿肌差异表达cDNA片段生物信息学及表达分析

1.差异显示cDNA片段序列的分析

1.1各差异显示cDNA片段序列

1.2各差异显示片段的基本信息

2.不同品种鸡腿肌差异表达cDNA片段的生物信息学分析

2.1分析方法

2.2相似性搜索

3.不同品种鸡差异表达标签的分析

3.1不同品种鸡差异表达标签的已知基因的分析

3.2与家鸡的某些核酸序列同源但功能未知的EST

4.讨论与分析

4.1表达序列标签的电子延伸

4.2电子基因定位分析

4.3 EST所对应的基因组序列分析

5.关于不同品种初生鸡腿肌差异显示的基因

5.1 COX基因(cytochrome oxidase，COX)

5.2肌肉肌酸激酶基因(M-CK,muscle creatine kinase)

5.3 1 4-3-3ε(1 4-3-3 epsilon)基因

5.4其他差异显示基因

第五章总结

主要参考文献

致谢

附录1所用差异显示引物序列信息

附录2基因芯片杂交过程

附录3作者简介