四个小麦品种上白粉菌的侵染过程观察及基因差异表达分析

摘要

小麦白粉菌（Blumeria graminis f.sp.tritici）引起的小麦白粉病是世界各个小麦主产区的主要病害之一，目前防治白粉病最为有效的措施是抗病育种。然而，小麦白粉菌变异极快，导致小麦品种抗性丧失加快，抗性品种使用年限大大缩短，严重威胁了小麦的产量和质量。因此，对小麦白粉菌变异机制的研究具有重要意义。本研究采用mRNA差异显示分析技术，探索小麦白粉菌在不同小麦品种上的基因表达差异，分离差异表达的基因片段，并进行生物信息学分析。　　1.从田间采集白粉菌，分离纯化后，转接到四个含有不同抗性基因的小麦品种川农26、川育20、西科2号、内麦12上，并对小麦白粉菌的侵染过程进行了细胞学观察，显微观察白粉菌分生孢子侵染初期的芽管长度变化及乳突的形成情况。结果表明，小麦白粉菌在抗、感材料上分生孢子形成芽管的长度有明显差异，乳突形成时间基本一致，而抗性材料上乳突形成百分率在28h后仍保持在较高水平，与感病材料差异明显。　　2.接种后，分别从四个小麦品种上收集白粉菌分生孢子，提取RNA，反转录，对DDRT-PCR条件进行了优化，结果表明:DNA Taq聚合酶2.5U、退火温度40℃、引物浓度100uM最为适宜。以3个锚定引物和26个随机引物组合，共78对引物组合，以反转录产物为模版进行DDRT-PCR，PCR产物经电泳检测后，共找出差异片段44条。　　3.将部分差异片段进行测序，得到四个测序结果(B-1、B-2、B-3、B-4)，利用软件和在线分析工具进行生物信息学分析。　　B-1，序列长度129bp，来源于川育20上收集的白粉菌CY20，引物组合B0327/B0310。该片段的推定蛋白与来自小麦白粉菌菌株96224的序列有60％的相似性，编码产物为鞘氨醇C4羟化酶。该推定蛋白共43个氨基酸，分子质量为5.131KD，等电点为11.543，不稳定性系数为58.54，属于不稳定蛋白，脂溶指数为54.42，总平均亲水性为-1.342。PredictProtein预测该蛋白二级结构中α-螺旋16.28％，β-折叠23.26％，β-转角60.47％。该蛋白的最大疏水指数为1.344，最小疏水指数为-3.356。　　B-2，序列长度674bp，来源于西科2号上收集的白粉菌XK2，引物组合B0328/B0302，将其最长的开放阅读框264bp翻译为氨基酸序列，与来自小麦白粉菌菌株96224的序列的相似性为60％，其功能是编码核糖体线粒体蛋白。该序列推定蛋白共87个氨基酸，分子质量为9.496KD，等电点为5.421，不稳定性系数为49.04，属于不稳定蛋白，脂溶指数为98.74，总平均亲水性为-0.014。PredictProtein预测该蛋白二级结构中α-螺旋6.90％，β-折叠22.99％，β-转角70.11％。该蛋白的最大疏水指数为2.322，最小疏水指数为-1.756。　　B-3，序列长度323bp，来源于川农26上收集的白粉菌CN26，引物组合B0328/B0305，通过在NCBI网站上进行BLAST相似性比对和分析，发现此序列与小麦白粉菌菌株96224的序列相似，相似性为52％，其功能是编码凝集素相关蛋白。该序列的推定蛋白分子质量为10.661KD，等电点为9.032，不稳定性系数为29.01，属于稳定蛋白，脂溶指数为123.26，总平均亲水性为0.764。PredictProtein预测该蛋白二级结构包含α-螺旋72.63％，β-折叠4.21％，β-转角23.16％。该蛋白的最大疏水指数为3.333，最小疏水指数为-3.044。　　B-4，序列长度204bp，来源于内麦12上收集的白粉菌NM12，引物组合B0328/B0313，该片段的推定蛋白与来自小麦白粉菌菌株96224的序列有64％的相似性，编码产物是假定蛋白，功能目前还不清楚。该序列的推定蛋白分子质量为6.387KD，等电点为9.18，不稳定性系数为75.63，属于不稳定蛋白，脂溶指数为62.68，总平均亲水性为-1.125。PredictProtein预测该蛋白二级结构中α-螺旋0％，β-折叠23.21％，β-转角76.79％。该蛋白的最大疏水指数为1.022，最小疏水指数为-3.189。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 小麦白粉病的研究现状

1．1．1 小麦白粉病发生分布和危害

1．1．2 病原菌

1．1．3 病害症状

1．1．4 病原菌生物学特性

1．1．5 病害侵染循环

1．1．6 小麦抗白粉病基因的类型、位点和来源

1．1．7 小麦白粉菌的变异

1．1．8 侵染过程观察

1．2 几种基因差异表达研究方法的比较

1．2．1 抑制差减杂交(SSH)

1．2．2 基因芯片技术(DNA microarray)

1．2．3 mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)

1．3 mRNA差异显示技术在各领域中的应用

2 研究的主要目的意义

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 供试菌株及小麦品种

3．1．2 主要试剂

3．1．3 仪器设备

3．2 试验方法

3．2．1 白粉菌的分离纯化

3．2．2 白粉菌的扩繁

3．2．3 供试材料接种

3．2．4 离体抗性鉴定

3．2．5 侵染过程观察

3．2．6 白粉菌的收集

3．2．7 总RNA提取

3．2．8 cDNA第一条链的合成

3．2．9 PCR条件的优化

3．2．10 DDRT-PCR

3．2．11 差异片段的统计

3．2．12 差异片段的序列测定

3．2．13 差异片段的生物信息学分析

4 结果与分析

4．1 离体抗性鉴定

4．2 侵染过程观察

4．2．1 芽管长度

4．2．2 乳突的形成

4．3 RNA的提取

4．4 PCR条件的优化

4．4．1 Taq DNA聚合酶

4．4．2 退火温度

4．4．3 引物浓度

4．5 DDRT-PCR

4．6 差异片段序列测定

4．7 差异片段的生物信息学分析

4．7．1 差异片段B-1的生物信息学分析

4．7．2 差异片段B-2的生物信息学分析

4．7．3 差异片段B-3的生物信息学分析

4．7．4 差异片段B-4的生物信息学分析

5 讨论

6 总结

参考文献

致谢