Dot-ELISA检测兔疥螨抗体方法的建立及兔疥螨可溶性蛋白的抗原性研究

摘要

疥螨病是由疥螨引起的呈世界性分布的人畜共患皮肤性寄生虫病。该病严重影响畜牧业的发展和人类健康，给社会经济和生态环境带来巨大危害。 感染疥螨病严重的动物有明显的临床症状，容易确诊。而轻度感染、感染早期或夏季潜伏期病例却较难发现，因此该病的早期诊断比较困难。目前国内关于疥螨病诊断方面的报道主要是病原学诊断，而国外资料报道兔疥螨的可检测血清抗体水平往往比典型的临床症状出现得早，且血清学诊断方法比临床诊断方法有更高的检出率，因此本研究用提取的可溶性蛋白作为诊断抗原建立了检测兔疥螨病血清抗体的Dot-ELISA方法。诊断抗原是将收集的各个阶段的兔疥螨经反复冻融、研磨、离心的方法获得。通过反复筛选，确定了该法的最佳反应条件：抗原最适包被浓度为12.03μg/ml，包被温度和时间为37℃30min，封闭液为1％BSA，封闭条件为37℃50min，抗原抗体反应条件为37℃50min，辣根过氧化酶标记的SPA(HRP-SPA)的最适工作浓度为1∶40，孵育条件为37℃50min，底物作用时间为15min，血清稀释液和洗涤液均为0.01MpH7.4PBST(含0.15mol/LNaCl、0.05％Tween-20)。阻断试验和交叉试验表明诊断膜片具有良好的特异性：不与兔瘟、大肠杆菌病、兔附红细胞体等阳性血清反应；膜片具有良好的灵敏性，高免血清作1∶210稀释亦能检出；重复性试验表明该法重复性良好。诊断膜片保存期长，在4℃保存5个月其检测活性不变。该方法操作简便快捷，2.5小时内即可完成。结果表明Dot-ELISA简便、快速、灵敏、特异，重复性好，结果客观、稳定，肉眼容易判定，不需要特殊仪器，诊断膜便于寄送、保存，各种试剂和材料都可作到标准化。Dot-ELISA为疥螨病的诊断和流行病学调查提供了良好的技术手段。 为了寻找诊断疥螨病的特异性抗原，本研究首先应用SDS-PAGE对提取的疥螨可溶性抗原组分进行分析，然后用疥螨高免血清、人工感染疥螨血清和阴性血清进行免疫印迹(Westernblot)。电泳结果表明提取的粗抗原中共分辨出23条蛋白条带，主要分子量范围在31～74KD和100～200KD之间，主带为200KD、145KD、100KD、65KD、45KD、36KD、31KD和28KD。免疫印迹结果表明高免血清与人工感染血清能识别许多相同的条带，但高免血清还能识别其它一些条带。另外，不同的人工感染血清识别的条带也有差异，最多的可识别15条条带，最少的仅能识别6条条带，但都能识别200、145、127、100KD四条蛋白带。

目录

文摘

英文文摘

论文独创性声明及关于论文使用授权的声明

前言

1文献综述

2研究的目的和意义

3材料和方法

4结果

5讨论

6结论

参考文献

致谢

附录 主要试剂的配置

在读期间发表论文情况