Dot-ELISA检测犬恶丝虫抗体方法的建立及犬恶丝虫可溶性蛋白的抗原性研究

摘要

犬恶丝虫病是由犬恶丝虫引起的呈世界性分布的寄生虫病，该病严重影响犬猫及小熊猫、狼、狐等多种野生肉食动物的健康。 感染犬恶丝虫病严重的动物有明显的临床症状，容易确诊。而轻度感染、感染早期或夏季潜伏期病例却较难发现，因此该病的早期诊断比较困难。目前国内关于犬恶丝虫病诊断方面的报道主要是病原学诊断，而国外资料报道犬恶丝虫的可检测血清抗体水平往往比典型的临床症状出现得早，且血清学诊断方法比临床诊断方法有更高的检出率，因此本研究用提取的可溶性蛋白作为诊断抗原建立了检测犬恶丝虫病血清抗体的Dot-EIASA方法。诊断抗原是将收集的犬恶丝虫经反复冻融、研磨、离心的方法获得。通过反复筛选，确定了该法的最佳反应条件：抗原最适包被浓度为16.41 μg/ml，包被温度和时间为37℃30 min，封闭液为1％BSA.，封闭条件为37℃50 min，抗原抗体反应条件为37℃60 min，辣根过氧化酶标记的SPA(HRP-SPA)最适工作浓度为1:4000，孵育条件为37℃60 min，底物作用时间为20 min，血清稀释液和洗涤液均为0.01M pH7.4 PBST(含0.2％Tween-20)。阻断试验和交叉试验表明诊断膜片具有良好的特异性：不与犬蠕形螨高免血清、犬钩口线虫高免血清、犬弓首蛔虫血清等阳性血清反应；膜片具有良好的灵敏性，高免血清作1：2<'8>稀释亦能检出；重复性试验表明该法重复性良好。诊断膜片保存期长，在4℃保存12个月其检测活性不变。该方法操作简便快捷，3.5小时内即可完成。结果表明Dot-ELISA简便、快速、灵敏、特异，重复性好，结果客观、稳定，肉眼容易判定，不需要特殊仪器，诊断膜便于寄送、保存，各种试剂和材料都可作到标准化。Dot-ELISA为犬恶丝虫病的诊断和流行病学调查提供了良好的技术手段。 为了寻找诊断犬恶丝虫病的特异性抗原，本研究应用SDS-PAGE对提取的犬恶丝虫可溶性抗原组分进行分析，然后用犬恶丝虫高免血清、自然感染犬恶丝虫血清和阴性血清进行免疫印迹(Western blot)。电泳结果表明提取的粗抗原中共分辨出23条蛋白条带，主要分子量范围在19～120 kDa.之间，主带为120、89、70、56、46、36、22和19 kDa。免疫印迹结果表明高免血清与自然感染血清能识别许多相同的条带，但高免血清还能识别其它一些条带。另外，不同的自然感染血清识别的条带也有差异，最多的可识别10条条带，最少的也能识别8条条带，但都能识别120、70、56、36、22和19 kDa六条蛋白带。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1文献综述

1.1犬恶丝虫抗原

1.2免疫应答

1.2.1非特异性免疫应答

1.2.2特异性免疫应答

1.3犬恶丝虫病的诊断

1.3.1 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)

1.3.2其它免疫学方法

1.3.3诊断试剂盒

1.3.4常规诊断方法

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物：

2.1.2血清

2.1.3主要仪器

2.1.4主要试剂

2.2方法

2.2.1犬恶丝虫诊断抗原的制备

2.2.2阳性血清和阴性血清的制备

2.2.3 Dot-ELISA方法的建立

2.2.4最佳反应条件的选择

2.2.5特异性试验

2.2.6重复性试验

2.2.7平行对照实验

2.2.8膜片保存期试验

2.2.9 Dot-ELISA检测犬恶丝虫抗体的初步应用

2.2.10免疫接种兔的抗体消长水平检测

2.2.11 SDS-PAGE检测犬恶丝虫粗抗原蛋白

2.2.12粗抗原蛋白的免疫印迹(半干式转移)

3结果

3.1粗提犬恶丝虫抗原含量的测定

3.2 DOT-ELISA的最佳工作条件

3.2.1最佳包被缓冲液和抗原浓度的选择结果

3.2.2最佳血清稀释液的选择结果

3.2.3 HRP-SPA最佳工作浓度和时间的选择结果

3.2.4最佳包被温度和时间的选择结果

3.2.5最佳封闭液和封闭时间的选择结果

3.2.6最适底物作用时间的选择结果

3.2.7最适反应温度和反应时间的选择结果

3.2.8最适洗涤剂的选择结果

3.3特异性实验

3.3.1交叉实验

3.3.2特异性阻断实验

3.4重复性实验

3.5平行对照实验

3.6膜片保存期试验

3.7 DOT-ELISA检测待检犬血清抗体水平的实验结果

3.7.1对50份未出现犬恶丝虫临床症状、剖检后未发现虫体的待检犬血清进行Dot-ELISA检测的结果

3.7.2对50份未出现犬恶丝虫临床症状的待检犬血清进行Dot-ELISA检测的结果

3.8对2只免疫兔免疫前后用DOT-ELISA检测其抗体消长规律

3.9犬恶丝虫可溶性抗原的分析

3.9.1犬恶丝虫粗抗原提取物蛋白的SDS-PAGE电泳结果

3.9.2犬恶丝虫可溶性抗原蛋白的免疫印迹结果

4讨论

4.1实验方法

4.1.1 Dot-ELISA技术

4.1.2 SDS-PAGE

4.1.3免疫印迹技术(WESTERN-BLOT)

4.2 DOT-EISA最佳条件的研究

4.3 DOT-ELISA方法阳性、阴性标准的初步确定

4.4待检犬血清抗体检测结果的分析

4.5犬恶丝虫可溶性抗原的分析

4.6免疫印迹在诊断中的应用

4.7对犬恶丝虫免疫机制的初步探讨

5结论

参考文献

致谢

附录

在读期间发表论文情况