25种四川地方晾晒烟遗传关系的SRAP分析

摘要

晾晒烟是雪茄烟和混合型卷烟的重要生产原料，也是进行我国烟草杂交育种的重要种质资源。四川省有悠久的晾晒烟栽培历史和丰富的地方晾晒烟种质资源。然而目前四川省晾晒烟品种的引种、繁种、留种等工作都是由烟农自己完成，缺乏系统性的管理。另外，由于没有标准的烟种命名方法，烟农往往根据烟草植株形态和叶片特征进行命名，这种命名方法用于形态特征不很明显的烟草时极易造成同种异名或同名异种的混乱现象。由于长期缺乏系统性研究和管理，致使四川许多地方性晾晒烟的品种来源不清，品种间遗传关系不明，这已成为改良和利用晾晒烟的限制性因素。 鉴定晾晒烟种质资源是加快晾晒烟品种改良和利用的基础。分子标记由于具有不受环境和其它因素的影响，稳定性和重复性好等优点，在烟草种质资源鉴定中被广泛应用。SRAP标记技术是一种新型的基于PCR的标记系统。前人研究表明，SRAP标记可以很好的应用在多种作物的遗传多样性研究中。目前SRAP标记在烟草种质资源上的研究应用，在国内外还很少有相关报道，其中涉及到晾晒烟资源的更是少之又少。因此将SRAP标记技术应用于烟草种质资源遗传多样性的研究中，尤其是地方晾晒烟的研究分析和鉴定评价，有助于更为准确地鉴定、评价现有种质资源，为地方晾晒烟种质资源的合理利用和优良新品种的培育提供更可靠的依据和选择手段。 本研究利用SRAP标记技术对25个四川地方晾晒烟(Sull-curedtobacco，Nicotianatabacum)材料进行了亲缘关系研究，并以1个烤烟(Flue-curedtobacco，Nicotianatabacum)和1个黄花烟(Nicotianarustia)材料作为参比；回收了部分特异标记条带进行克隆测序，并对测序结果进行了简单的生物信息学分析。主要研究结果如下： 1.对晾晒烟SRAP-PCR反应体系和程序进行了优化。在本实验中，晾晒烟SRAP-PCR最佳反应体系为：Mg2+浓度1.6mmol/L，1×Buffer，dNTP浓度0.2mmol/L，模版DNA浓度2ng/μL，Taq酶1U，正反引物总含量均为0.5pmol，反应总体积为25μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，33℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环：94℃变性1min，53℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸8min，4℃保存。优化后的晾晒烟SRAP体系重复性好、稳定性强。 2.从30对SRAP引物组合中选出扩增带纹丰富、清晰，且多态性位点百分比较高的引物组合25对。用此25对引物对27份供试烟草材料进行扩增。根据数据分析采样原则对扩增条带进行了统计。共检测到3368条扩增带，其中特异性性条带为998条，平均多态检出率为29.6％。说明SRAP标记技术可有效应用于地方晾晒烟草种质的分析。 3.根据SRAP数据计算出了烟草种质材料间的遗传相似系数。27份材料的遗传相似系数为0.26～0.97，平均为0.62；黄花烟与其它26种普通栽培烟草遗传差异极其明显，遗传相似系数在0.26～0.51之间：烤烟与其它25份晾晒烟品种之间的遗传相似系数也较低，在0.66～0.78之间；25份晾晒烟品种之间的遗传相似系数在0.75～0.97之间，平均为0.86，彼此间遗传相似性较高，而地方晾晒烟品种间遗传相似有一定差异，但总的遗传基础相对较狭窄。 4.用类平均法(UPGMA)对27份材料遗传相似系数进行聚类分析。聚类分析表明，当取遗传相似系数为0.74时，可将黄花烟、烤烟和晾晒烟品种明显区分开，反映出类型间的遗传差异；当取遗传相似系数为0.89时，可将25份晾晒烟材料3个大类和2个独立的个类；四川晾晒烟的两个传统类别毛烟和柳烟，未被明显地分聚为两类。 5.将SRAP标记出的部分特异性条带进行回收克隆测序，并对部分测序结果进行了初步的生物信息学分析。从结果上看，回收效果较好，回收片段长度都在200bp左右。大部分片段在进行Blastn和BlastX比对时，都能找到同源性较高的序列，从而推测其可能的蛋白质功能，只有片段EU430295未能在比对中找到同源性较高的片段，无法推测出其功能。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.文献综述

1.1 烟草分类

1.1.1 烟草的植物学分类

1.1.2 栽培烟草的分类

1.2 晾晒烟的使用价值

1.2.1 晾晒烟在卷烟工业上的应用

1.2.2 晾晒烟在烟草育种中的应用

1.3 晾晒烟种植现状

1.3.1 世界晾晒烟种植现状

1.3.2 我国晾晒烟种植现状

1.3.3 四川晾晒烟种植历史与现状

1.4 我国晾晒烟的种质研究现状与意义

1.4.1 我国晾晒烟种质研究现状

1.4.2 我国晾晒烟种质研究的意义

1.5 分子标记技术在烟草研究中的应用

1.5.1 限制性片段长度多态性(RFLP)

1.5.2 随机扩增多态性DNA(Random Amplification Polymorphism,RAPD)

1.5.3 简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)

1.5.4 简单序列重复间区(Inter-simple Sequence Repeat,ISSR)

1.5.5 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymerphism,AFLP)

1.5.6 相关序列扩增多态性(Sequence Related Amplified Polymorphism,SRAP)

2.本研究的目的和意义

3.材料和方法

3.1 材料、试剂和设备

3.1.1 材料

3.1.2 引物

3.1.3 主要设备

3.1.4 主要试剂和配方

3.2 实验方法

3.2.1 烟草基因组DNA的提取

3.2.2 DNA质量检测

3.2.3 SRAP反应体系和程序

3.2.4 6%变性聚丙烯酰胺电泳检测

3.2.5 数据统计分析

3.2.6 特异性PAGE条带回收，克隆测序

4.结果与分析

4.1 晾晒烟基因组DNA的提取

4.2 晾晒烟SRAP-PCR体系的建立

4.2.1 SRAP-PCR反应体系优化

4.2.2 SKAP-PCR反应程序的确定

4.3 扩增产物的多态性

4.4 供试材料的遗传关系

4.4.1 遗传相似系数分析

4.4.2 聚类分析

4.5 部分回收片段的克隆测序结果分析

4.5.1 EU430299和EU430302的生物信息分析

5. 讨论

5.1 SRAP标记在晾晒烟种质资源研究中的有效性和高效性

5.2 SRAP标记特异性条带克隆测序的可行性和意义

5.3 晾晒烟种质资源的亲缘关系

5.4 晾晒烟种质资源的利用

参考文献

致谢