猪霍乱沙门氏菌携带的含APP apxIIA基因的双启动子表达载体pEPR-apxIIA的构建

摘要

猪霍乱沙门氏菌C500株不仅可以作为预防猪沙门氏菌病的活疫苗，还可作为载体运送其他DNA疫苗，并通过口服免疫诱导产生针对特定抗原的各种免疫应答。本研究将rrnbT1T2转录终止序列插入真核表达质粒pEGFP-C1的多克隆位点MCS下游，构建成pEGFP-rrnBT1T2。然后根据原核启动子Ptrc结构设计并人工合成该杂合启动子，将其置于pEGFP-rrnBT1T2的真核启动子CMVIE下游，构建成双启动子表达载体pEGFPPtrcR，用1×TSS法转化已经鉴定好的猪霍乱沙门氏菌C500株，得到工程菌C500/pEGFPPtrcR，该菌的保持了C500原有的生长特性、生化特性及血清学特征，在体外至少能稳定遗传20代。为验证pEGFPPtrcR的有效性，检测了报告基因EGFP在原核细胞和真核细胞中表达情况。在荧光显微镜下可观察到单个工程菌C500/pEGFPPtrcR发出绿色荧光，经SDS-PAGE检测表达蛋白约为27KD，与预期相符。采用脂质体介导法将pEGFPPtrcR质粒转染真核Vero细胞24h后也观察到绿色荧光。表明，能同时进行原核和真核表达的双启动子表达载体pEGFPPtrcR构建成功。预示双启动子表达载体pEGFPPtrcR携带的外源基因既可在沙门氏菌C500中表达，又可在体细胞中表达，抗原的表达量增加因而可诱导更强的免疫应答，在研制新型重组沙门氏菌疫苗方面有着诱人的应用前景。 猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病，给世界养猪业造成了严重的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。参照GenBank中APP的apxⅡA基因序列，设计一对特异性引物(apxⅡA 1和apxⅡA2)，以本实验室分离的APP-CYY株的基因组DNA为模板，扩增出apxⅡA全基因，测序结果显示，apxⅡA基因全长2871bp，与GenBank中其他5个APP菌株的apxⅡA同源性高达99.5-99.9％。氨基酸序列分析，该基因编码957个氨基酸，具有典型RTX毒素特征，无信号肽。将该基凶插入双启动子表达载体pEGFPPtrcR的MCS中，构建成双启动子表达质粒pEPR-apxⅡA，用1×TSS法转化猪霍乱沙门氏菌C500株，得到工程菌C500/pEPR-apxⅡA，该菌保持了C500原有的生长特性、生化特性及血清学特征，在体外至少能稳定遗传20代。其在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，经SDS-PAGE检测，EGFP与apxⅡA的融合表达蛋白约为130KD。用脂质体介导法将pEPR-apxⅡA质粒转染真核 Vero 细胞细胞24h后也检测到绿色荧光。证明，双启动子表达质粒pEPR-apxⅡA构建成功，可在原核细胞和真核细胞中表达。为构建以C500为载体的高效猪传胸DNA活疫苗打下了坚实的基础，进而为研制猪传染性胸膜肺炎和仔猪副伤寒二价疫苗的开辟了道路。 invA基因是沙门氏菌的侵袭蛋白，可通过同源重组的方式将其缺失突变从而可能进一步降低猪霍乱沙门氏菌C500的毒力。以C500基因组为模板，扩增了C500 invA两侧基因invB和invE；以pEGFPPtrcR质粒为模板，扩增了pTER，含有原核启动子Ptrc和EGPF。按照沙门氏菌基因组中invB-invA-invE基因的排列方向和顺序，将它们连接入pUC18载体中，并通过酶切补平连接方式，除去了inB端的Hind Ⅲ和invE端的EcoRI酶切位点，保证pTER中MCS的使用完整性。构建成以C500 invA两侧翼序列invB和invE的为同源臂，以pTER为打靶序列的转移载体p18BE-pTER。该质粒的构建为以后C500的基因工程减毒奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

1作为疫苗和疫苗载体的胞内菌-沙门氏菌

1.1沙门氏菌侵入机体途径

1.2重组减毒沙门氏菌诱发宿主机体免疫应答的机制

1.3沙门氏菌的基因工程减毒

1.4减毒的沙门氏菌中表达异源抗原的方式

1.5减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的应用及前景

1.6减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的优势

1.7以减毒沙门氏菌为载体的DNA疫苗的潜在威胁

2猪传染性胸膜肺炎放线杆菌

2.1猪传染性胸膜肺炎的流行病学及危害

2.2猪传染性胸膜肺炎致病机理

2.3 APP的主要毒力因子

2.4 Apx毒素的分子结构

2.5猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展

第一章 含EGFP的双启动子表达载体pEGFPPtrcR的构建及在猪霍乱沙门氏菌C500和Vero细胞中的表达

1材料与方法

1.1质粒、菌株和细胞

1.2酶和其它试剂

1.3仪器设备

1.4猪霍乱沙门氏菌C500标准株生长特性、生化特性、药敏特性及血清学鉴定

1.5双启动子表达载体pEGFPPtrcR的构建

1.6重组质粒pEGFPPtrcR转化猪霍乱沙门氏菌C500株

1.7工程菌C500/pEGFPPtrcR生长特性、生化特性、药敏特性及血清学鉴定

1.8工程菌C500/pEGFPPtrcR中质粒的体外遗传稳定性实验

1.9重组质粒pEGFPPtrcR在原核细胞猪霍乱沙门氏菌C500中的表达

1.10重组质粒pEGFPPtrcR在真核Vero细胞中的表达

2实验结果与分析

2.1猪霍乱沙门氏菌C500标准株生长特性、生化特性、药敏特性及血清学鉴定

2.2双启动子表达载体pEGFPPtrcR的构建

2.3工程菌C500/pEGFPPtrcR的鉴定

2.4工程菌C500/pEGFPPtrcR生长特性、生化特性、药敏特性及血清学鉴定

2.5工程菌C500/pEGFPPtrcR中质粒的体外遗传稳定性

2.6重组质粒pEGFPPtrcR在原核细胞C500中表达的检测

2.7重组质粒pEGFPPtrcR在真核Vero细胞中的表达检测

3讨论

4结论

第二章 含猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的apxⅡA基因的双启动子表达载体pEPR-apxⅡA的构建

1材料与方法

1.1质粒、菌株和细胞

1.2酶和其它试剂

1.3仪器设备

1.4猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP基因组DNA的提取

1.5 apxⅡA基因的扩增

1.6 apxⅡA扩增产物的电泳检测

1.7含APP的apxⅡA基因的双启动子表达载体pEPR-apxⅡA的构建

1.8重组质粒pEPR-apxⅡA转化猪霍乱沙门氏菌C500株

1.9工程菌C500/pEPR-apxⅡA生长特性、生化特性、药敏特性及血清学鉴定

1.10工程菌C500/PEPR-apxⅡA中质粒的遗传稳定性实验

1.11重组质粒pEPR-apxⅡA在原核细胞猪霍乱沙门氏菌C500中的表达

1.12重组质粒pEPR-apxⅡA在真核Vero细胞中的表达

2实验结果与分析

2.1 apxⅡA基因的扩增

2.2重组质粒pEPR-apxⅡA的鉴定

2.3 apxⅡA基因的序列分析

2.4 apxⅡA基因的氨基酸序列分析

2.5工程菌C500/pEPR-apxⅡA的鉴定

2.6工程菌C500/pEPR-apxⅡA生长特性、生化特性、药敏特性及血清学鉴定

2.7工程菌C500/pEPR-apxⅡA中质粒的遗传稳定性

2.8重组质粒pEPR-apxⅡA在原核细胞C500中的表达

2.9重组质粒pEPR-apxⅡA在Vero细胞中的表达

3讨论

4结论

第三章 含原核启动子和绿色荧光蛋白基因的重组转移载体p18BE-pTER的构建

1材料与方法

1.1质粒、菌株和细胞

1.2酶和其它试剂

1.3仪器设备 同第一章

1.4猪霍乱沙门氏菌C500基因组DNA的提取

1.5 invB基因和invE基因的PRC扩增

1.6 invB基因和invE基因扩增产物的电泳检测和回收

1.7 invB基因和invE基因扩增产物的T载体连接和转化以及筛选

1.8重组质粒T-invB和T-invE的鉴定

1.9重组质粒pUC18-E的构建

1.10重组质粒pUC18-BE的构建

1.11含原核启动子和绿色荧光蛋白基因的重组转移载体p18BE-pTER的构建

2实验结果

2.1 invB基因和invE基因的扩增、克隆与序列测定

2.2重组质粒pUC18-invE的鉴定

2.3重组质粒pUC18-E的鉴定

2.4重组质粒pUC18-invBE的鉴定

2.5重组质粒pUC18-BE的鉴定

2.6 pTER的PCR产物的鉴定

2.7重组转移载体p18BE-pTER X的鉴定

2.8重组转移载体p18BE-pTER X中pTER的方向性鉴定

3讨论

4结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况