组氨酸残基的化学修饰对酪氨酸酶活性和构象的影响

摘要

酪氨酸酶(EC1.14.18.1)是生物体合成黑色素的关键酶。酪氨酸酶广泛分布于生物有机体中，在黑色素合成代谢途径中具有多种催化功能。该酶的生物学活性中心有一个双铜活性部位，每个铜离子以一价或二价分别与3个组氨酸结合，它们通过氧化态(Eoxy)、脱氧态(Edeoxy)和还原态(Emet)直接参与不同的催化反应。由于酪氨酸酶具有多种催化功能，其催化机理非常复杂，不同来源的酪氨酸酶表现出不同的催化反应机制，需要通过不同的动力学方法来研究。酪氨酸酶的晶体结构至今仍未阐明，鉴于该酶在实际应用中的广泛性，因此深入研究酶作用的催化机制，以及酶的活性中心意义重大。 本文根据蘑菇酪氨酸酶的基因序列(GenBank，AJ223816)，存在非共价结合的游离组氨酸和半胱氨酸残基，使得添加化学试剂形成配体结合形式具有可能。当底物(L-酪氨酸或L-多巴)与酶活性中心结合时，这些残基在某种程度上将参与催化反应。因此，在本研究中为阐明位于酪氨酸酶活性中心的游离组氨酸残基的作用，用溴乙酸(BrAc)作修饰剂，发现溴乙酸修饰后的组氨酸残基可显著降低酶的活性。进一步以BrAc为修饰剂研究其抑制动力学，并通过荧光检测手段了解修饰后的酶的构象变化。结果表明，组氨酸被BrAc修饰不仅显著的抑制酪氨酸酶，而且使其构象发生改变。Br离子的结合直接诱导了酪氨酸酶疏水表面的暴露并引起酶活性的降低，可能暗示该酶活性位点具有柔性。本文利用酶促反应抑制动力学的方法和荧光检测手段，提示酪氨酸酶活性位点具有柔性的特征，并发现游离组氨酸残基可能参与了酪氨酸酶活性中心的底物结合的新线索，为酪氨酸酶抑制剂的设计和找寻提供理论基础。

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第一章综述

1酪氨酸酶

1.1酪氨酸酶概述

1.2酪氨酸酶的研究进展

1.3酪氨酸酶抑制剂的研究进展

1.4酪氨酸酶的应用研究

2酶化学修饰的研究

2.1酶化学修饰研究概况和意义

2.2酶化学修饰的研究方法和技术

3本论文设计思想

第二章材料和方法

1 实验材料

1.1主要试剂

1.2主要仪器

1.3主要溶液的配制

2实验方法

2.1酪氨酸酶活性检测方法

2.2 BrAc对酪氨酸酶活性的影响

2.3抑制动力学测定方法

2.4 pH值对BrAc抑制酶活性的分析方法

2.5酶的内源荧光光谱学分析方法

2.6酶的ANS荧光光谱学分析方法

第三章结果与讨论

1 BrAc对酪氨酸酶活性的影响

2 BrAc对酪氨酸酶抑制类型的分析

3 BrAc对酪氨酸酶抑制作用的分析

4 pH值的变化对BrAc抑制酶活性的影响

5酶的内源荧光光谱学分析

6酶的ANS荧光光谱学分析

小结

参考文献

致谢