极细链格孢菌功能基因HIS3及LEU2的初步研究

摘要

极细链格孢菌(Alternariatenuissima)是一种植物病原真菌，对农业生产危害巨大，然而其在生防、环保等方面也有应用，因此从分子水平研究该菌的功能基因的调控机制，对进一步开发利用该菌具有重要意义。在真核微生物的遗传学研究中LEU2和HIS3基因是重要的营养标记，通过遗传学手段，我们筛选获得了极细链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因，并且研究了AtLEU2及AtHIS3基因互补酿酒酵母的功能。以G418抗性基因作为选择标记，构建了用于敲除极细链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的质粒，建立了极细链格孢菌的遗传转化系统，为进一步研究AtLEU2及AtHIS3基因的功能奠定了坚实的基础，主要研究结果如下： 1、将极细链格孢菌cDNA表达文库转化到酵母LEU2缺失突变株，用SD-LEU培养基进行筛选，获得了3个正常生长的酵母转化子。对转化子质粒进行测序分析，发现这些基因编码的蛋白质序列均与酵母LEU2(ScLEU2)基因编码的363个氨基酸同源(命名为AtLEU2，其编码的蛋白质命名为Atleu2p)，该基因编码的蛋白与植物病原菌小麦颖枯病CAB72262；灰葡萄孢霉EDN21270；玉蜀黍赤XP_386851，以及水稻稻瘟病病菌XP367617所编码的β-苹果酸脱氢酶同源，相似性分别达到94％、74％、1％和69％，与酿酒酵母、粗糙链孢霉EAA33847相似性为70％和63％。 2、将极细链格孢菌cDNA表达文库转化到酵母HIS3缺失突变株，在SD-HIS培养基上筛选，获得了2个正常生长的转化子。所得基因的开放阅读框(ORF)含有717个碱基，编码238个氨基酸，与酵母HIS3(ScHIS3)基因同源(命名为AtHIS3，其编码的蛋白质命名为AtHis3p)，AtHis3p与植物病原真菌链格孢BAF69039，小麦颖枯病EAT83561，灰葡萄孢霉EDN23196，玉蜀黍赤霉XP_386269，以及水稻稻瘟病病菌XP367617中编码的咪唑甘油磷酸脱水酶同源，相似性分别达到100％，90％，68％，65％和63％；与生防菌哈茨木霉P34041相似性达64％；与酿酒酵母，粗糙链孢霉XP961386编码的蛋白相似性达64％和66％。 3、分别选择以AtLEU2及AtHIS3基因上下游同源序列500bp左右作为同源臂，在上游同源序列3’端连接(3418抗性基因(以保证缺失突变株的检测及鉴定)，构建了用于敲除极细链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的质粒，为在极细链格孢菌中敲除AtLEU2及AtHIS3基因奠定了坚实的基础，为进一步研究链格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的功能及作用机理提供了重要的试验材料。 4、基于极细链格孢菌在含有G418(100μg/mL)的PDA培养基上不能生长的药物敏感性实验结果，建立了用G418抗性基因作为选择标记的遗传转化系统，从而为研究极细链格孢菌功能基因的敲除、缺失突变株鉴定提供了可靠的筛选标记，并为后续研究打下必要的基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1研究进展

1.1链格孢菌研究概况

2极细链格孢菌功能基因的研究

3丝状真菌的转化

3.1研究概况

3.2转化中的选择标记

第二章编码LEU2和HIS3基因的极细链格孢菌cDNA文库分离和鉴定

1实验材料

1.1菌株及质粒

1.2培养基

2试验方法

2.1极细链格孢菌cDNA表达文库质粒转化酵母缺失菌株

2.2AtHIS3基因及AtLEU2基因的cDNA分离

2.3酵母质粒(DH5α)复验检测

3实验结果

3.1转化效率及转化子数量

3.2BsrGI酶切酵母质粒(DH5α)

3.3酵母质粒(DH5α)互补酵母缺失株

3.4酵母质粒(DH5α)测序结果分析

4结论与讨论

第三章极细链格孢菌LEU2及HIS3基因敲除质粒构建及原生质体转化体系的建立

1实验材料

1.2主要试剂、酶及载体

1.3培养基和试剂

2实验方法

2.1链格孢菌药物敏感性试验

2.2LEU2和HIS3基因敲除质粒构建

2.3原生质体转化体系的建立

3实验结果

3.1药物敏感性测定

3.2LEU2基因敲除质粒的构建

3.3HIS3基因敲除质粒的构建

3.4原生质体转化体系的建立

4结论与讨论

4.1筛选标记

4.2敲除质粒的构建

4.3原生质体转化体系的建立

参考文献

致谢

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