玉米自交系478叶与根酵母双杂交文库的构建及评价

摘要

玉米是重要的饲料、工业原料和粮食作物，随着分子生物学技术和育种手段的进步和更新，越来越多的新技术和新手段被应用到玉米育种与生产的基础研究中，酵母双杂交系统是研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与RNA，蛋白质与小分子等的相互作用的有用技术，通过建立玉米骨干自交系的根、叶片、发育胚乳等细胞的cDNA文库，并构建合适的诱饵质粒载体，来筛选和诱饵蛋白相互作用的一个或一组蛋白质，研究它们之间的相互作用关系，对于研究玉米根、叶片与发育胚乳的生理功能和大分子物质的功能及作用网络具有十分重要的意义，同时，能为玉米育种提供一定的理论依据。 本文利用SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)技术，通过同源重组的方法，在酵母菌株AH109中构建玉米根及叶片全长cDNA文库。以根及叶片不同发育时期的mRNA为模板，反转录合成cDNA第一链，再在DNA聚合酶作用下，通过长距离PCR，扩增双链cDNA(ds cDNA)。将扩增得到的双链cDNA经过柱层析分离纯化去除小片段的不完整的cDNA。将得到的纯化dscDNA与线性化pGADT7-Rec质粒载体共同转化酵母菌株感受态AH109，经胞内同源重组形成环状文库质粒。应用营养缺陷的方法在SD/-Leu平板上筛选并收集所有克隆从而获得玉米根及叶片的酵母双杂交全长cDNA文库。所获得的根文库的转化效率为1.76×10<'7>转化子/3μg pGADT7-Rec，滴度为1.17×10<'6>pfu/ml，重组率为95％，重组片段均大于500bp，所获得的叶片文库的转化率为1.54×10<'7>转化子/3μg pGADT7-Rec，滴度为1.03×10<'6>pfu/ml，重组率为95％，重组片段均大于500bp，表明在酵母菌株AHl09成功构建了用于酵母双杂交的玉米根及叶片的cDNA文库。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 文献综述

1 cDNA文库的研究进展

1.1 cDNA文库构建的基本原理与方法

1.2 cDNA文库的类型

1.3构建cDNA文库的注意事项

1.4 cDNA文库的检测与筛选

1.5 cDNA文库的应用意义

2酵母双杂交系统的研究进展

2.1酵母双杂交系统的基本原理

2.2酵母双杂交系统的优缺点

2.3酵母双杂交系统的衍生系统

2.4酵母双杂交系统的应用意义

2.5酵母双杂交系统在植物学上的应用

3立题依据与技术路线

3.1立题依据

3.2技术路线

第二部分 材料与方法

1 试验材料

1.1植物材料

1.2试剂和酶

1.3菌体与载体

2 试验方法

2.1总RNA的提取和检测(TRIzol 试剂法)

2.2 mRNA的分离纯化和检测(磁珠分离法)

2.3 cDNA第一链的合成和检测

2.4双链cDNA的合成和检测(LD-PCR)

2.5双链cDNA的纯化(CHROMA SPINTMTE-400 Column 柱分离法)

2.6用ds cDNA和pGADT-Rec质粒转化感受态酵母AH109

2.7在SD/-Leu培养基上筛选转化株

2.8获取转化株

第三部分 结果与分析

1 总RNA的提取和mRNA的分离纯化

2 双链cDNA的合成及纯化

3 文库的鉴定

第四部分 结论与讨论

参考文献

致谢

附录