禽传染性支气管炎病毒基因双顺反子DNA疫苗及mRNA3的分子特性研究

摘要

1、本研究采用PCR扩增获取鸡的IL-2、IL-18基因，将其插入pMD18-T载体中进行测序鉴定。对含有S1、M、N目的基因的pIBVS1、pIBVM、pIBVN质粒进行测序分析。结果表明，IL-2、IL-18、S1、M、N基因全长分别为432bp、536bp、1671bp、678bp和1230bp，鉴定的目的基因正确。以pDsRed-Express-N1载体为骨架，以内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite)序列为连接元件构建绿色和红色荧光基因的双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red，转染Vero细胞后观察到绿色和红色荧光基因均获得表达。构建的pIRES-EGFP/Red载体含有卡那霉素抗性基因，比含有氨苄抗性的双顺反子载体具有更高的生物安全性，为今后开展各种病原微生物双顺反子DNA疫苗的研制提供研究工具。 2、用S1、M、N基因与IL-2、IL-18基因分别替换pIRES-EGFP/Red质粒中的荧光基因，构建双顺反子表达质粒pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES-M/IL18和pIRES-N/IL18及其单基因表达质粒，转染Vero细胞，利用RT-PCR及间接免疫荧光检测质粒在体外的表达。RT-PCR检测表明转染了重组质粒的Vero细胞中均能特异的扩增出S1、M、N和(或)IL-2、IL-18基因片段；间接免疫荧光检测表明，转染了重组质粒的细胞显示出黄绿色荧光，而转染了空质粒的细胞则没有显示出任何特异荧光。本研究为IBV结构基因和细胞因子双顺反子DNA疫苗免疫试验提供了材料。 3、采用本课题组获得专利(专利号为200410081443.4)的质粒提取、纯化方法制备质粒，将质粒溶液(1mg/mL)与脂质体溶液(10mg/mL)等体积混合配制成DNA疫苗。将配制的DNA疫苗通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡，28日龄加强免疫一次。分别在免疫前和免疫后7、14、21、28、35d采血检测ELISA抗体效价和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量。二免后两周用IBV强毒进行攻毒。ELISA抗体水平结果显示：pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗组产生的抗体水平高于pIRES-S1、pIRES-M、pIPES-N疫苗组，在免疫后14-35d，差异显著(P＜0.05);pIRES-M/IL18、pIRES-N/IL18疫苗组产生的抗体水平也高于pIPES-M、pIRES-N疫苗组，在免疫后14-35d，差异显著(P＜0.05)，pIRES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组产生的抗体水平与pIRES-S1+plRES-IL2、pIPES-S1+pIRES-IL18疫苗组相比在免疫后21-35d差异显著(P＜0.05)；外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示：pIRES-S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIRES-N/IL2疫苗组在免疫后7-28d，与pIRES-S1、pIRES-M、pIPES-N疫苗组相比差异显著(P＜0.05)，pIRES-S1/IL18、pIPES-M/IL18、pIRES-N/IL18疫苗组在免疫后14-28dCD3+、CD4+T、CD8+T淋巴细胞亚群的数量高于pIRES-S1、pIRF-M、pIPES-N疫苗组，差异显著(P＜0.05)。pIPES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量较pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIRES-IL18DNA疫苗组高，但差异不显著(P＞0.05)。攻毒结果表明，双顺反子DNA疫苗组的保护率介于65％～85％，其中RES-S1/IL2、pIRES-S1/IL18疫苗组的保护率分别为85％和75％，高于混合质粒pIRES-S1+pIRES-IL2、pIRES-S1+pIPES-IL18DNA疫苗组的70％和60％。其中pIRES-S1/IL2疫苗组的保护率85％高于灭活疫苗组的攻毒保护率75％。本研究研制出的IBV结构蛋白与IL-2、IL-18双顺反子DNA疫苗，为提高IBVDNA疫苗的免疫效率提供了新的途径。 4、采用RT-PCR获取IBVE基因，用以替换pIRES-M/Red质粒中的红色荧光基因，构建双顺反子表达质粒pIRES-M/E，转染Vero细胞后进行表达检测。采用本论文第三章的方法制备DNA疫苗和进行动物免疫试验。结果表明：在免疫后7-35d，pIPES-M/E免疫组产生的抗体水平及外周血T淋巴细胞亚群数量高于pIRES-M组，但差异不显著(P＞0.05)；pIRES-M/E、pIRES-M组对强毒的攻击保护率分别为55％和40％，且低于灭活疫苗的攻毒保护率(75％)。本研究构建了IBV的M基因和E基因双顺反子DNA疫苗并对其免疫原性进行了研究，结果初步认为E基因对M基因免疫的协同作用不明显。 5、采用RT-PCR方法对IBVmRNA3(3a3b3c)区域进行了克隆、测序及分子特性分析，测序表明3a3b3c片段大小为734bp，包含完整的3a、3b、3c(E)基因，与GenBank上公布的58株IBV毒株的相应序列的同源率介于78.2％～96.1％之间，与CK/CH/LGD/04II毒株和CK/CH/LSC/99I毒株的同源率最高(96.1.％和95.9％)。对3a3b序列的RNA二级结构进行预测，结果表明两者具有相同的二级结构，但二级结构的稳定性存在差异。进一步构建3a3b的双荧光基因共表达质粒p3a3b-EGFP/Red，并对其IRES功能进行检测，结果没能检测到3a3b序列下游红色荧光基因的表达。本研究表明3a3b3c序列的分子特征与毒株的遗传变异存在相关性，为IBV的分子流行病学研究提供了新的途径。3a3b基因片段的内部核糖体进入位点功能要弱于脑心肌炎病毒的IRES序列，因此筛选高效的IRES序列用于新疫苗载体的构建还需要进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

选题背景

1.禽传染性支气管炎研究概况

2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况

3.细胞因子作为基因佐剂的研究进展

4.双顺反子质粒载体的国内外研究进展

5.禽传染性支气管炎病毒分子生物学及mRNA3分子特性研究进展

本研究前期工作基础

存在的主要问题

本研究的内容和目的意义

第一章S1、M、N、IL-2、IL-18目的基因鉴定及双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的构建、鉴定

摘要：

1.引言

2.材料与方法

2.1材料

2.2方法

3.结果

3.1 IL-2、IL-18基因的扩增及测序结果

3.2 IBV S1、M、N结构基因的测序结果

3.3中间质粒pcEGFP的酶切鉴定

3.4中间质粒pEGFP-IRES的酶切鉴定

3.5双顺反子表达质粒pIRES—EGFP/Red的酶切鉴定

3.6双顺反子表达质粒pIRES—EGFP/Red的表达结果

4.讨论

4.1 S1、M、N、IL-2、IL-18目的基因的测序鉴定

4.2双顺反子表达质粒pIRES-EGFP/Red的构建与鉴定

5.小结

第二章禽传染性支气管炎病毒结构蛋白基因S1、M、N分别与IL-2/IL-18双顺反子表达质粒的构建及鉴定

摘要：

1.引言

2.材料与方法

2.1材料

2.2方法

3.结果

3.1 pIRES—S1/Red、pIRES—M/Red、pIPES-N/Red质粒的酶切鉴定

3.2 S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒的酶切鉴定

3.3 pIRES—S1、pIRES-M、pIPES-N质粒的酶切鉴定

3.4 pIEES—IL2、pIRES—IL18质粒和空质粒的酶切鉴定

3.5 S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒转录产物的RT—PCR检测结果

3.6 S1、M、N基因分别与IL-2、IL-18双顺反子质粒表达产物的间接免疫荧光检测结果

4.讨论

4.1结构基因与细胞因子双顺反子表达质粒的构建策略

4.2双顺反子表达质粒转染真核细胞的方法

4.3传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的体外表达

5.小结

第三章pIRES—S1/IL2、pIRES—M/IL2、pIRES—N/IL2、pIRES-S1/IL18、pIRES—M/IL18、pIRES—N/IL18双顺反子DNA疫苗的配制和免疫原性研究

摘要：

1.引言

2.材料与方法

2.1材料

2.2方法

3.结果

3.1质粒的鉴定

3.2脂质体的电镜观察

3.3脂质体与质粒转染比例的筛选结果

3.4 pIRES—S1/IL2、pIRES-M/IL2、pIPES—N/IL2、pIPES—S1/IL18、pIRES-M/IL18、pIRES—N/IL18双顺反子DNA疫苗免疫后ELISA抗体的检测结果

3.5 pIPES—S1/IL2、pIPES—M/IL2、pIRES—N/IL2、pIPES—S1/IL18、pIPES-M/IL18、pIPES-N/IL18双顺反子DNA疫苗免疫后外周血淋巴细胞亚类的检测结果

3.6攻毒实验结果

4.讨论

4.1质粒的制备和DNA疫苗的配制

4.2 S1、M、N基因与IL-2/IL-18双顺反子DNA疫苗的免疫效果

4.3双顺反子DNA疫苗与混合DNA疫苗免疫效果的比较

4.4关于攻毒保护率

5.小结

第四章pIRES—M/E真核表达质粒的构建及免疫原性研究

摘要：

1.引言

2.材料与方法

2.1材料

2.2方法

3.结果

3.1 E基因的RT—PCR扩增结果

3.2 E基因的测序结果

3.3双顺反子表达质粒pIPES-M/E的酶切鉴定

3.4转录产物的RT-PCR检测结果

3.5 pIPES-M/E双顺反子DNA疫苗的制备

3.6 pIREs-M/E双顺反子DNA疫苗免疫后ELISA抗体效价的检测结果

3.7 pIRES-M/E双顺反子DNA疫苗免疫后外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量的检测结果

3.8攻毒保护

4.讨论

4.1 M基因和E基因共表达DNA疫苗的免疫原性

5.小结

第五章禽传染性支气管炎病毒mRNA3的分子特性研究及其内部核糖体进入功能的检测

摘要：

1.引言

2.材料和方法

2.1材料

2.2方法

3.结果

3.1 mRNA3(3a3b3c)RT-PCR扩增、克隆测序、序列分析结果

3.2 3a3b核苷酸序列的二级结构预测

3.3重组质粒p3a3b-EGFP/Red的酶切鉴定

3.4 p3a3b—EGFP/Red与pIRES—EGFP/Red的比较及3a3b内部核糖体进入位点的分析结果

4.讨论

4.1本研究所用毒株的mRNA3(3a3b3c)分子与国内外的比较及特点

4.2 3a3b编码区二级结构预测结果

4.3 3a3b与IRES序列的功能比较

5.小结

结论

文献综述

1. 禽传染性支气管炎病毒的概述

2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究进展

3.细胞因子作为基因佐剂的研究进展

4.双顺反子表达质粒的国内外研究进展

5.禽传染性支气管炎病毒分子生物学及3a、3b分子特性研究进展

参考文献

致谢

附录：英汉缩略名词对照表

在读博士期间发表的论文情况