黑麦属NBS类抗病基因同源序列分析

摘要

黑麦属（Secale L．）是小麦的三级基因源，其中蕴藏着优异抗病基因，为普通小麦抗病育种提供了丰富的基因资源。本研究根据已知的NBS-LRR类抗病基因结构中的氨基酸保守结构域设计兼并引物，对黑麦属5个物种的抗病基因同源序列（RGAs）进行了克隆及其分析。主要研究结果如下： 1．根据已知的抗病基因保守结构域NBS-LRR结构设计了10对引物，以黑麦属5个物种基因组DNA为模版，进行PCR扩增和克隆，共获得了45条RGAs序列。序列分析表明，16条RGAs具有连续的开放阅读框（ORFs），其他29条RGAs序列有提前终止子或移码突变，不具有连续的ORF。 2．对这16个具有完整ORF的RGAs序列进行结构功能域分析，结果表明这16个RGAs序列都含有NBS类抗病基因的典型保守结构域，如P-loop、Kinase-2和GLPL。对这16个RGAs序列与已知抗病基因（L6、RPP5、RPM1、PM3A）进行氨基酸同源性比较，结果表明这16个RGAs序列与亚麻抗锈病基因L6、拟南芥抗霉霜病基因RPP5、拟南芥抗丁香假单细胞菌基因RPM1、小麦抗白粉病基因PM3A相应区域氨基酸均具有不同程度的相似性。 3．16个来自黑麦属RGAs的氨基酸序列均表现出明显的NB-ARC保守结构域的特征。其中RGA1、RGA2、RGA4和RGA5与来源于偏凸山羊草的抗病蛋白氨基酸序列的相似性达到86％-94％，RGA3、RGA4和RGA14与来源于大麦的抗病蛋白氨基酸序列的相似性分别为77％、78％、84％。RGA11和RGA13与来源于多年生黑麦草抗病蛋白氨基酸序列的相似性达到94％和98％。 这些黑麦抗病基因同源序列的获得，可为定位，克隆黑麦抗病基因及其利用分子标记辅助选择育种提供研究基础，且对了解黑麦中NBS-LRR类R基因的起源和进化有一定得参考价值。

目录

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声明

1.文献综述

1.1 植物抗病基因的结构与功能特点

1.1.1 核苷酸结合位点(nucleotide binding site,NBS)

1.1.2 富亮氨酸重复(leucine rich repeat,LRR)

1.1.3 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Ser/Thr kinase,STK)

1.1.4 亮氨酸拉链结构(leucine zipper,LZ)

1.1.5 Toll—白介素—1 区(tol-interleukin-1 Region,TIR)

1.2 植物抗病基因克隆

1.2.1 图位克隆法

1.2.2 转座子标签克隆法

1.2.3 抗病基因同源序列克隆法

1.3 植物抗病基因同源序列研究进展

1.3.1 植物基因组中R基因及其同源序列的分布

1.3.2 R基因及其同源序列在基因组中的存在形式

1.3.3 RGAs与R基因的关系

1.3.4 植物抗病基因的应用

1.5 黑麦抗病资源在小麦中的应用

1.6 立题依据

2.材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.2.1 DNA 提取

2.2.2 PCR引物设计、扩增基因组、克隆及测序

2.2.3 PCR产物回收、纯化

2.2.4 T—载体连接

2.2.5 感受态细胞的制备

2.2.6 热击转化

2.2.7 阳性克隆的筛选

2.2.8 序列测定与比较分析

3.结果与分析

3.1 黑麦RGAs分离与鉴定

3.2 黑麦RGAs核苷酸序列聚类分析

3.3 黑麦RGAs保守结构域分析

3.4 黑麦RGAs氨基酸序列与已知抗病基因相应区域相似性分析

3.5 黑麦RGAs氨基酸序列的同源性检索

4.讨论

4.1 黑麦RGAs的分离与鉴定

4.2 黑麦RGAs的多样性及其进化关系分析

参考文献

致谢