鸡IL-18变构基因与新城疫病毒HN基因融合表达载体的构建及体外抗马立克病肿瘤细胞的研究

摘要

新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)是一种溶癌病毒，可在肿瘤细胞内增殖、抑制并裂解肿瘤细胞。研究发现，NDV的包膜糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)基因是NDV抗肿瘤的功能性基因，是NDV抗肿瘤作用的重要分子基础。IL-18具有明显的抗肿瘤作用，在肿瘤治疗和肿瘤基因治疗方面具有潜在的应用前景。为探讨删基因及IL-18基因融合后抗肿瘤作用及其机制，本研究分别构建了HN基因、ChMIL-18基因及HN基因和ChMIL-18基因融合后的重组表达载体pPICZαA-HN、pPICZαA-ChMIL18和pPICZαA-HN-ChMIL18，经诱导表达后，其目的蛋白均具生物学活性，进而以鸡马立克病肿瘤细胞系-MSB-1为体外研究对象，对MSB-1细胞的增殖抑制作用及其机制等方面进行了初步研究，结果表明，HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均可抑制肿瘤细胞生长，HN-ChMIL18融合蛋白对细胞抑制作用明显强与HN蛋白，其原因可能是ChMIL-18蛋白对HN蛋白致肿瘤细胞凋亡有增强作用，而ChMIL-18蛋白虽具有淋巴细胞增殖活性，但对肿瘤细胞无明显的抑制作用，其为进一步研究HN基因和ChMIL-18基因融合蛋白体内抗马立克肿瘤奠定了基础，具有重要的理论和实际意义。 1.目的基因的获得及生物信息学分析 1.1ChMIL-18目的基因的获得根据Genbank中鸡IL-18成熟蛋白基因序列设计一对特异性引物，利用RT-PCR技术，从外周血淋巴细胞中扩增到了鸡IL-18成熟蛋白基因全序列，将其克隆至pMD18-T载体并测序，对测序结果进行生物信息学分析，结果表明：序列全长为507bp，其理论分子量为19.5KD，等电点为6.36，无糖基化位点，具抗原性等。为提高具有生物活性的ChIL-18的表达量，应用反向长距离PCR定点突变技术对鸡IL-18成熟蛋白基因第28位和第37位的Arg密码子进行同义突变，将毕赤酵母中低频密码子CGA突变为高频密码子AGA，获得突变体pMD18-T-ChMIL18，将其转化至E.coliJM109中，抽提质粒，经酶切和PCR鉴定后，进行测序，测序结果与原ChIL18比对表明突变成功，获得了目的突变基因。 1.2HN基因的获得应用RT-PCR方法对NDVLaSota株HN基因进行了扩增与克隆，得到大小约为1.7Kb的LaSota株HN基因，与Genbank中登录的HN基因大小一致；扩增序列经PCR、酶切鉴定及序列测定证实与预计结果相符；用DNAStar及在线分析软件对HN基因的生物信息学进行分析，其结果为：HN基因共577个氨基酸，理论分子量为63.0KD，等电点为7.54，12个半胱氨酸残基，5个N-糖基化位点，与B1、Clone30、LaSota、JI1和HB92核苷酸同源性在98.8％-99.8％，氨基酸同源性分别为98.896-99.5％。 1.3HN-ChMIL18融合基因的获得根据表达载体pPICZαA及克隆载体pBluescriptSK+(pBsSK+)的多克隆位点，设计HN基因的引物(含柔性接头)，在两端分别引入KpnI和BamHI酶切位点，以及变构体MIL-18引物(含柔性接头)，在两端分别引入BamHI和NotI酶切位点。分别以pMD18-T-HN、pMD18-T-ChMIL18为模板扩增得到融合基因片段HNf和ChMIL-18f，并克隆至pMD18-T载体，构建了克隆载体pMD18-T-HNf、pMD18-T-ChMIL18f。 重组质粒pMD18-T-HNf和pBSSK+分别用/KpnI/BamHI双酶切，片段回收产物按适当比例连接，转化E.coliJM109感受态细胞，重组质粒命名为pBSSK+-HN。然后，重组质粒pMD18-T-ChMIL18f和pBSSK++HN分别用BamHI、NotI双酶切，回收产物按适当比例连接，转化E.coliJM109感受态细胞，重组质粒鉴定正确后命名为pBSSK+-HN-ChMIL18，经酶切、PCR鉴定及序列比对表明获得了目的基因HN-ChMIL18。 2.表达载体的构建、诱导表达及表达产物的活性检测 2.1表达载体pPICZαA-ChMIL18的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pMD18-T-ChMIL18和pPICZαA分别用EcoRI、KpnI双酶切，电泳回收纯化ChMIL18和pPICZαA双酶切产物，按适当比例进行连接，转化到E.coliJM109感受态细胞中，鉴定结果表明获得了重组质粒pPICZαA-ChMIL18。将重组质粒pPICZαA-ChMIL18用SacI酶切线性化，电脉冲方法克隆至PichiaPastoris(P.Pastotris)X-33感受态细胞中，经高抗性筛选、PCR鉴定结果表明pPICZαA-ChMIL18已整合入P.PastorisX-33染色体中，用1％甲醇对其进行诱导表达，SDS-PAGE结果表明目的蛋白存在于上清中，分子量约为23KD，Westernblot结果表明表达产物具良好的免疫原性，淋巴细胞转化试验结果表明ChMIL18具有促淋巴细胞增殖的活性。 2.2表达载体pPICZαA-HN的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pPICZαA和重组质粒pMD18-T-HN分别用KpnI/NotI双酶切，电泳回收纯化HN和pPICZαA片段，按适当的比例进行连接，克隆至E.coliJM109感受态细胞中，经酶切及PCR鉴定，结果表明获得了重组质粒pPICZαA-HN。重组质粒pPICZαA-HN用SacI酶切线性化，电击转化入P.PastorisX-33感受态细胞中，经高抗性筛选、PCR鉴定证明pPICZαA-HN已整合入X-33的染色体上，对其进行诱导表达，SDS-PAGE、Western-blot及血凝试验结果表明上清中有目的蛋白，其分子量约为97KD，且具良好的免疫原性和凝集红细胞的活性。 2.3表达载体pPICZαA-HN-ChMIL18的构建、诱导表达及表达产物的活性检测质粒pBSSK+-HN-ChMIL18和pPICZαA分别用KpnI/NotI双酶切，电泳回收HN-ChMIL18与pPICZαA双酶切产物并纯化，按适当比例进行连接，克隆至E.coliJM109感受态细胞，酶切及PCR鉴定结果表明获得了重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18。重组质粒pPICZαA-HN-ChMIL18用SacI酶切线性化后，电击转化入酵母菌X-33感受态细胞中，高抗性筛选和PCR鉴定结果表明pPICZαA-HN-ChMIL18已整合入X-33染色体上，对其进行诱导表达，SDS-PAGE、Western-blot结果表明目的蛋白为分泌性表达，分子量约为103KD，具良好的免疫原性，同时，淋巴细胞转化试验、血凝试验证明表达产物具有促进淋巴细胞增殖和凝集红细胞的活性。 3.体外抗马立克肿瘤细胞系MSB-1的初步研究 以马立克氏病肿瘤细胞系-MSB-1为体外研究对象，分别将ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养后，通过增殖抑制试验、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪等方法探讨其抑制机制，MTT结果表明HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白对MSB-1细胞的增殖有抑制作用，并呈剂量相关性，而ChMIL-18蛋白无抑制作用；琼脂糖凝胶电泳分析发现，ChMI-18蛋白、删蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养一段时间后，HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均出现DNA断裂现象；ChMIL-18蛋白、HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白与MSB-1细胞共培养后，流式细胞仪检测发现HN蛋白、HN-ChMIL18融合蛋白均引起MSB-1细胞出现了凋亡，而且HN-ChMIL18融合蛋白引起的凋亡数量比HN蛋白多，而单独的ChMIL18不能引起MSB-1细胞凋亡。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写

声明

第一部分文献综述

第一章MD防制研究进展

1鸡马立克氏病疫苗研究进展

2接种途径

3抗病育种

4生物安全性措施

第二章鸡IL-18基因研究进展

1不同动物IL-18的分子结构

2 IL-18的表达调控

3 IL-18受体

4 IL-18的生物学功能

5 IL-18的抗肿瘤细胞及其作用机制

第三章NDV HN基因研究进展

1 NDV抗肿瘤机制

2 HN蛋白结构及其毒力基础

3 FIN蛋白的抗肿瘤机制

研究目的意义

第二部分实验研究

第四章 鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆、测序及生物信息学分析

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第五章鸡IL-18成熟蛋白基因的定点突变及序列分析

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第六章 鸡IL-18成熟蛋白基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及表达

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第七章 NDV LaSota株HN基因的克隆及序列分析

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第八章HN基因毕赤酵母表达载体pPICZα A-HN的构建及表达

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第九章 鸡IL-18变构基因和HN基因融合毕赤酵母表达载体的构建及其表达

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第十章ChMIL-18、HN及HN-ChMIL-18表达条件的优化、表达产物的纯化及生物活性检测

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第十一章 ChMIL-18、HN及HN-ChMIL18融合蛋白体外抗MD肿瘤的研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第三部分结论

第四部分参考文献

第五部分附录

致谢

作者简介