鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白酵母表达条件的优化及生物活性研究

摘要

白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)是近年发现的一种细胞因子，具有诱生IFN-γ、促进T细胞增殖分化等生物学功能，在宿主防御、抗变态反应、抑瘤抗瘤等方面具有重要作用。同时IL-18作为天然的免疫调节剂和疫苗佐剂克服了使用传统药物成本高，副作用大等缺点，是一种可以替代传统疗法的新型免疫调节剂，具有很大的应用前景。目前国内外对IL-18的研究主要集中在人和鼠等哺乳动物，而对鸡IL-18的研究，特别是增强免疫方面的报道较少。故此，本研究在对酵母表达系统中表达的鸡IL-18与新城疫病毒HN基因融合蛋白进行表达条件优化、纯化的基础上，分别对不同形式IL-18和HN联合免疫雏鸡的免疫应答情况进行了比较检测，为进一步研究鸡IL-18的生物学功能及其在疫苗中的应用奠定基础。
　　 本研究对已构建好的携带有IL-18与HN融合基因的重组酵母菌遗传稳定性进行了分析，筛选优化了其最佳表达条件，实现了融合基因在酵母中高效表达；表达蛋白经纯化、定量后分别用Western bloting、MTT等方法在体外对其生物学活性进行分析。结果表明，该重组工程菌能稳定地表达鸡IL-18-HN融合蛋白。其在培养液pH6.5、甲醇诱导浓度1.5[％]、诱导温度30℃的条件下诱导156h，目的蛋白的表达量最高，为400mg/L。纯化后的体外活性检测试验表明，其表达的鸡IL-18-HN融合蛋白具有明显的刺激淋巴细胞增殖的活性。同时将含有鸡IL-18-HN融合基因的重组质粒PSK-HN-IL18，应用KpnⅠ和NotⅠ双酶切，切出HN-IL18融合基因，回收并连接经相同酶切的真核表达载体pcDNA3，成功构建了含有HN和IL-18融合蛋白基因的pcDNA3-HN-IL18真核表达载体。
　　 在上述工作基础上，对鸡IL-18-HN融合蛋白免疫效果通过实验鸡进行了检测。试验共分6组，即融合蛋白组、HN蛋白组、真核表达的ChIL-18组、HN蛋白+真核表达的ChIL-18组、pcDNA3-HN-IL18组和空白对照组，每组50只，正常饲养程序饲养至8日龄时各组进行免疫接种，试验组在用颈部皮下注射方式分别进行不同类型的新城疫免疫，每只剂量50μg，空白对照组注射相同剂量的生理盐水，pcDNA3-HN-IL18组每只剂量20μg，12日龄用同样方式进行二免，分别于免疫后的第4d，7d，14d，21d，28d对其血清的抗体效价、外周血的T淋巴细胞转化水平及其NO分泌、免疫器官指数及免疫器官T淋巴细胞数和免疫器官IgG抗体生成细胞进行测定，并在26日龄时每组取20只用于动物攻毒保护试验。结果表明：IL-18和HN蛋白联合使用可以明显增强新城疫的免疫效果。与单独的HN组相比，联合免疫组试验雏鸡血清中抗体水平、T淋巴细胞转化水平和巨噬细胞分泌NO的能力显著提高，较好促进了免疫器官的生长发育和成熟，免疫器官T淋巴细胞数量和IgG抗体生成细胞数量明显增多，融合蛋白的使用进一步强化了这种作用。