鸭瘟病毒UL32基因的原核表达及在病毒感染宿主亚细胞定位研究

摘要

论文对本研究小组新鉴定的DPV CHv株UL32基因（GenBank登录号EF643561）开展了以下系列研究：DPV UL32基因分子特性密码子偏爱性分析、克隆、原核表达和抗体制备、在病毒感染宿主鸭胚成纤维细胞中的表达产物亚细胞定位检测、转录和表达时相分析，结果如下： 1．鸭瘟病毒UL32基因序列分子特性及密码子偏爱性分析DPV UL32基因大小为1962bp，编码653aa，包含1个保守结构域，为Herpes_env，是疱疹病毒科推定的包装糖蛋白。系统进化树分析表明，DPV在分类地位上归属于Alphaherpesvirus亚科。通过信号肽、跨膜区、磷酸化位点和疏水性进行分析预测，该基因编码的蛋白不存在跨膜区和信号肽结构，含有多达33个潜在的磷酸化位点，是一个亲水性蛋白质。密码子偏爱性分析结果显示，编码UL32蛋白相同氨基酸的不同密码子使用频率有较大的差异，并且DPV UL32基因与大肠杆菌、酵母和人的密码子使用偏爱性差异分别有24、28和29个，因此，DPV UL32的密码子偏爱性与原核生物较为接近，与真核生物及人相差较大，其基因表达选择在大肠杆菌等原核系统较为合适。 2．UL32基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备通过构建pET-32a-UL32重组原核表达载体，利用IPTG进行诱导表达，得到大小约为92．2KD的重组融合蛋白，与预期表达的蛋白大小相一致。薄层扫描分析表明重组蛋白占菌体总蛋白的33．1％，主要以包涵体的形式存在。最佳表达优化条件为1．0 mmol/L的IPTG，25℃下诱导5h。利用纯化的重组蛋白制备兔抗高免血清，琼扩效价为1：16。兔抗UL32蛋白IgG经辛酸-硫酸铵盐析和Hig-Q阴离子交换层析纯化，具高效、特异性强的优点。 3．DPV UL32基因产物在宿主细胞中的表达与亚细胞定位通过细胞免疫荧光进行病毒感染DEF的亚细胞定位检测，结果表明特异性荧光在感染后10h的细胞质中检测到，感染后16h开始在细胞核内聚集；感染后24h在细胞核的特定区域聚集，这些毗邻深染的区域外被认为是病毒粒子的装配位点，可能聚集衣壳到复制区促进病毒DNA的壳体化；感染后48h在细胞核内均匀分布。 4．鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL32基因转录及表达时相分析 用SYBR GreenⅠ染料法检测各时间段收取的细胞样品，从10h开始目的基因的表达量增加，60h达到最高值，此后表达量又开始逐渐降低，但是70h的表达量依然很高，为278。而表达时相的结果是UL32蛋白在感染后12小时可见少量表达，60h达到最大值，72h表达量下降，表达时相和转录时相结果说明UL32基因的转录表达规律总体上符合基因由转录到翻译的生命周期规律，而且基本满足转录在前表达在后的模式，DPV UL32基因是一个晚期基因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

本论文的创新性研究工作

第一部分 文献综述及选题的目的意义

第一章 鸭瘟病毒的概述及分子特性

1 鸭瘟概述

2 鸭瘟病毒概述

3 疱疹病毒UL32基因及其编码蛋白的研究进展

4 选题的目的和意义

第二部分 试验研究

第二章 鸭瘟病毒UL32基因序列分子特性分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 鸭瘟病毒UL32基因克隆表达及多克隆抗体制备

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第四章 鸭瘟病毒UL32基因编码蛋白的亚细胞定位

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第五章 鸭瘟病毒UL32基因转录及表达时相分析

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三部分 结 论

参考文献

致 谢

作者简介