鸭瘟病毒U26基因原核表达及宿主细胞中的定位研究

摘要

本文围绕本实验室发现的DPV UL26基因（GenBank登录号EF643565）进行了以下系列研究：DPV UL26基因分子特性、克隆、原核表达和抗体制备、表达产物细胞定位检测、实时荧光定量RT-PCR方法研究的转录时相分析和western blotting方法研究的表达时相分析等，获得以下结果： 1．鸭瘟病毒UL26基因分子特征分析 DPV UL26基因大小为2124bp，编码707aa。通过信号肽、跨膜区、磷酸化位点和疏水性进行分析预测，该基因编码的蛋白不存在跨膜区和信号肽结构，含有多达55个潜在的磷酸化位点，是一个亲水性蛋白质。通过进化树分析发现该基因属于α-疱疹病毒属，并且GaHV-2、GaHV-3、MeHV-1等禽类疱疹病毒的进化关系最近，与其他疱疹病毒关系则较远。 2．UL26基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备 通过构建pET-32/UL26重组原核表达载体，利用IPTG进行诱导表达，得到大小为97kD的重组融合蛋白。与预期表达的蛋白大小一致，主要以可溶性蛋白形式存在。优化后最佳表达条件为0．2 mmol/L的IPTG，30℃下诱导6h。重组蛋白纯化后制备的兔抗血清琼扩效价为1：32。 3．鸭瘟病毒UL26基因产物在宿主细胞中的表达与细胞定位 DPV感染宿主细胞后，用间接免疫荧光的方法检测到UL26编码的蛋白位于细胞胞核中。病毒感染8h后即可在细胞中检测到荧光；18h开始大部分细胞的整个胞核均有绿色荧光聚集；40h后开始出现局部荧光减弱；56h后细胞轮廓模糊，所有细胞胞核内荧光出现显著减弱并出现核分裂，细胞核形态不一。 4．鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL26基因转录及表达时相分析 转录时相是通过荧光定量PCR用相对定量的方法检测该基因转录的情况。用SYBRGreenⅠ染料法检测各时间段收取的细胞样品检测到：从10h开始目的基因的转录量开始增加，38h达到最高值，此后表达量逐渐降低，直至70h仍可以检测到目的基因的转录量。表达时相的结果是UL26蛋白在感染后12h可见少量表达，40h达到最大值后56h表达量开始下降。转录时相和表达时相结果共同说明UL26基因的转录表达规律总体上符合基因由转录到翻译的生命周期规律，而且基本满足转录在前表达在后的模式，且DPV UL26基因是一个晚期基因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

本论文的创新性研究工作

第一章 疱疹病毒UL26 基因的研究进展

1.鸭瘟概况

1.1 引言

1.2 鸭瘟的病原学

1.3 流行病学

1.4 临床症状和病理变化

1.5 DPV的分离与鉴定

2.疱疹病毒UL26 基因研究

2.1 UL26 基因序列及其编码蛋白的特点

2.2 UL26 蛋白酶的功能研究概况

2.3 UL26 蛋白与其它蛋白的关系

2.4 展望

3.选题目的和意义

第二章 鸭瘟病毒UL26 基因分子特性的分析

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.结果

2.1 DNA序列的测定与分析

2.2 DPV UL26 基因及编码蛋白的生物信息学分析

3.讨论

3.1 关于生物信息学及新基因功能的预测

3.2 序列的生物信息学分析

3.3 UL26 蛋白结构与功能分析

3.4 UL26 序列密码子使用分析

第三章 鸭瘟病毒UL26 基因克隆、表达及多克隆抗体的制备

1.材料

1.1 菌株/载体

1.2 实验动物

1.3 主要试剂及配制

1.4 主要仪器设备

1.5 其它

2.试验方法

2.1 DPV基因组DNA提取

2.2 PCR扩增鸭瘟病毒CHv株UL26 基因

2.3 UL26 基因的T—载体克隆与鉴定

2.4 UL26 基因重组表达菌株的构建

2.5 重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化

2.6 重组蛋白的纯化

2.7 兔高免血清的制备

2.8 DNA斑点杂交检测DPV UL26 基因

2.9 琼脂扩散试验检测兔抗DPV UL26 抗体效价

2.10 兔抗DPV UL26 高免血清IgG的纯化及鉴定

3.结果

3.1 鸭瘟病毒UL26 基因的扩增、克隆与鉴定

3.2 重组表达质粒pET—32—UL26 的构建及鉴定

3.3 重组蛋白的诱导表达及表达条件优化

3.4 重组蛋白的纯化

3.5 Western—blotting检测

3.6 斑点杂交结果

3.7 兔抗DPV UL26 血清琼扩效价的检测

3.8 兔抗DPV UL26 IgG的纯化及SDS—PAGE鉴定

4.讨论

4.1 关于表达系统及表达质粒的选择

4.2 关于目的基因的PCR扩增及其产物的酶切

4.3 诱导条件的优化

4.4 UL26 蛋白的纯化

4.5 抗血清的制备

第四章 鸭瘟强毒UL26 基因产物在宿主细胞中的表达与细胞定位

1.材料

1.1 毒株/细胞

1.2 主要试剂及配制

1.3 主要仪器设备

2.实验方法

2.1 间接免疫荧光检测DPV UL26 细胞定位方法的建立及优化

2.2 DPV UL26 基因产物细胞定位的动态监测

3 结果

3.1 间接免疫荧光检测DPV UL26 细胞定位方法的建立及优化

3.2 DPV UL26 基因产物细胞定位的动态监测

4 讨论

4.1 关于蛋白定位研究的方法

4.2 病毒UL26 蛋白感染宿主细胞的定位分析

4.3 关于UL26 蛋白在宿主细胞定位的时相分析

4.4 DPV UL26 蛋白与抗病毒药物研究的初步探讨

第五章 病毒体外感染宿主细胞UL26 基因转录及表达时相分析

1.材料

1.1 毒株/细胞

1.2 主要试剂及仪器

1.3 主要仪器设备

2.实验方法

2.1 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL26 转录时相分析

2.2 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL26 基因的表达时相分析

3.结果

3.1 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL26 转录时相分析

3.2 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL26 基因的表达时相分析

4 讨论

4.1 关于荧光定量PCR转录时相分析

4.2 关于Western—blot表达时相分析

结论

参考文献

致谢