宫内发育迟缓和营养对新生仔猪消化道生长发育及坏死性肠炎发生机理的研究

摘要

试验一宫内发育迟缓和营养对新生仔猪消化道生长发育及坏死性肠炎(NEC)发生率的影响
　　 本试验分3个试验考察宫内发育迟缓(IntrauterineGrowthRestriction，IUGR)对不同出生时间的仔猪（按期出生或早产）消化道生长发育及NEC发生率的影响。
　　 试验1首先研究了IUGR对按期出生仔猪内脏器官和消化道生长发育及功能的影响。
　　 试验2考察早产的IUGR仔猪在不同营养来源（初乳vs.配方乳）喂养时消化道生长发育和NEC发生率与NBW仔猪间的差异。母猪92％妊娠期(105d)剖腹产获取早产仔猪，根据选择标准若仔猪出生体重比平均重低1.5倍标准差的为IUGR仔猪；出生体重介于平均值±1.0倍标准差之间则被认为NBW仔猪。共选择出25头IUGR仔猪(n=25)和63头NBW仔猪(n=63)。IUGR仔猪又被分为初乳和配方乳饲喂组(初乳组，n=8；配方乳组，n=17)，NBW仔猪也分为初乳和配方乳饲喂组（初乳组，n=21;配方乳组，n=42）；所有仔猪通过手术插入胃导管于婴儿培养箱内进行总肠内营养(totalenteralnutrition，TEN)喂养（15m1·3h-1·Kg-1体重）。结果表明：与NBW仔猪相比，IUGR仔猪新生后（24h内）有着较高的死亡率(24％vs.18％，P＜0.18)；但存活下来的IUGR仔猪，无论是初乳还是配方乳饲喂，其肠道相对重量均高于NBW仔猪(+25-30％，P＜0.05)，且IUGR仔猪肠道组织氨基肽酶A和氨基肽酶N的活性要高于NBW仔猪(P＜0.05)，但肠黏膜比例、小肠绒毛高度和隐窝深度等形态学指标在两组间没有差异；通过荧光原位杂交技术(FluorescenceInSituHybridization，FISH)获得的肠黏膜微生物图谱也没有表明两组间微生物粘附的明显差异；NEC发生率在IUGR和NBW仔猪间差异不显著。但是，无论出生体重高低（即IUGR或NBW），与配方乳饲喂相比，初乳可显著提高仔猪肠黏膜重比例(+20％，P＜0.05)和绒毛高度(+40-46％，P＜0.05)，消化酶活性（氨基肽酶A，氨基肽酶N，二肽酰肽酶Ⅳ和麦芽糖酶）(P＜0.05)，肠黏膜微生物粘附局限于肠黏膜表面，但配方乳饲喂时微生物却有明显嵌入绒毛隐窝深处的现象。
　　 试验3进一步考察了总肠外营养(totalparenteralnutrition，TPN)介入时IUGR仔猪和NBW仔猪间消化道生长发育及NEC发生率的差异，仔猪选择标准同试验2，共有早产的21头IUGR仔猪和84头NBW仔猪。仔猪出生后在婴儿培养箱中饲喂，前2d采用自动灌注泵将TPN营养液经脐带动脉管实时灌注，而后2d则通过胃插管人工喂养（15ml·3h-1·Kg-1体重），分别饲喂母猪初乳（IUGR仔猪，n=12；NBW仔猪，n=65）和配方乳（IUGR仔猪，n=9;NBW仔猪，n=19）。结果表明：TPN介入后IUGR仔猪新生期（24h内）的死亡率比NBW仔猪高(31％vs.8％，P＜0.01)；IUGR仔猪直肠温度明显低于NBW仔猪（35.7±0.3vs.37.0±0.3，P＜0.01）。同试验2，无论是在配方乳还是初乳饲喂组，IUGR仔猪小肠相对重量和小肠相对长度均显著高于NBW仔猪(+50-80％，P＜0.01和+30-40％，P＜0.05)，但两组间肠道黏膜比例、绒毛高度/隐窝深度比和消化酶活性等无明显差异；肠黏膜微生物粘附和NEC发生率在两组间仍然差异不显著。无论IUGR还是NBW仔猪，初乳饲喂提高了消化酶活性包括氨基肽酶A、氨基肽酶N、二肽酰肽酶Ⅳ、麦芽糖酶和乳糖酶(P＜0.05)，肠黏膜微生物粘附也被有效地降低，且与配方乳相比，初乳明显降低了NBW仔猪的NEC发生率(P＜0.05)。相比于仅TEN喂养2d的仔猪（试验2），TPN介入后微生物黏附增加且有向绒毛深处及隐窝嵌入的趋势，NEC发生率明显升高（初乳饲喂组：61％vs.34％，P＜0.01;配方乳饲喂组：22％vs.5％，P=0.095）。以上结果表明，与NBW仔猪相比，早产IUGR仔猪的消化道生长发育并没有象按期出生IUGR仔猪一样受到宫内发育迟缓的影响，新生期存活下来的早产IUGR仔猪消化道生长发育和功能表现出较强的适应肠内营养的能力，IUGR仔猪的NEC发生率与NBW仔猪相似。出生后2d的TPN介入不能改善IUGR仔猪存活率，却增加了NEC发生率。无论是IUGR还是NBW仔猪，以初乳形式供给的肠内营养促进了早产仔猪消化道生长发育和功能，并阻碍肠黏膜微生物粘附进而降低了NEC发生率。
　　 试验二免疫应激对不同出生时间仔猪肠上皮细胞养分吸收功能和炎症因子基因表达的影响为了考察不同发育程度的仔猪肠上皮细胞养分吸收和炎症因子表达对免疫应激的反应，采用剖腹产技术分别获取92％妊娠期的早产仔猪(105d妊娠)和按期出生仔猪（114d妊娠），并在0d(n=6)和吮乳2d后(n=6)分别分离肠上皮细胞进行体外短期培养。处理组包括LPS添加组(100μg/ml)、TNF-α添加组(50μg/ml)和NEC-MIX添加组(1/4v./v.DMEM)、对照组为DMEM基础培养液，其中NEC-MIX是从患NEC的仔猪消化道内容物分离所得。各免疫刺激因子与原代肠上皮细胞(intestinalepithelialcells，IECs)共同培养4h后检测养分吸收（亮氨酸和葡萄糖）和炎症因子TNF-α、IL-6和INF-y的基因表达。结果表明：1）新生时(0日龄)，与对照组（无免疫因子刺激）相比，NEC-MIX和TNF-α降低了按期出生和早产的仔猪肠上皮细胞亮氨酸吸收(-25-30％，P＜0.05)，而早产仔猪肠上皮细胞葡萄糖吸收也受到NEC-MIX的刺激而降低(-30％，P＜0.05)。吮乳2d后，与对照组相比，仅早产仔猪肠上皮细胞亮氨酸吸收受到NEC-MIX刺激而下降(P＜0.05)。2)与来自按期出生仔猪的较成熟的肠上皮细胞相比，新生时（0日龄）早产仔猪肠上皮细胞在NEC-MIX刺激下亮氨酸吸收显著降低，而葡萄糖吸收在LPS和NEC-MIX刺激下也显著低于按期出生仔猪肠上皮细胞(P＜0.05)。吮乳2d后这种不同发育程度的肠上皮细胞对亮氨酸和葡萄糖吸收的差异却仅仅在NEC-MIX刺激组可见。3)新生（0日龄）时，无论是按期出生仔猪还是早产仔猪肠上皮细胞，与对照组无免疫因子添加组相比，炎症因子TNF-α基因表达在受到NEC-MIX刺激时均明显提高(P＜0.05)，而早产仔猪中炎症因子IL-6和INF-γ的基因表达还受到免疫因子LPS或NEC-MIX刺激而明显提高。4）与发育较成熟的按期出生仔猪肠上皮细胞相比，同一免疫因子(NEC-MIX)刺激下早产仔猪肠上皮细胞炎症因子TNF-α和IL-6的基因表达显著升高(P＜0.05)。总体上，免疫刺激因子促进了肠上皮细胞炎症因子的表达，且新生时（0日龄）免疫应激下炎症因子TNF-α、IL-6的基因表达要依赖于肠上皮细胞发育成熟度；但是吮乳2d后不同发育程度的肠上皮细胞在免疫因子刺激下炎症因子IL-6基因表达却未表现出差异。以上结果表明，免疫应激下早产仔猪的肠上皮细胞无论是炎症因子释放还是养分吸收均受到较为明显和广泛的刺激，免疫应激促进炎症因子表达的同时也抑制了养分吸收，暗示肠上皮细胞的养分吸收可能受到炎症因子释放的影响，两天的初乳饲喂促进了早产仔猪消化道的成熟，因而受到免疫应激时其养分吸收和炎症因子表达与按期出生仔猪较为相似。
　　 试验三新生仔猪消化道坏死性肠炎(NEC)的蛋白组学研究为迸一步探讨坏死性肠炎发生的机理，给按期出生仔猪和早产仔猪分别饲喂2d配方乳，通过NEC评估和形态学鉴定选取健康或发生坏死的肠道组织，在此基础上利用一维等电点电泳和二维垂直SDS-PAGE凝胶电泳技术分离组织蛋白质，二维凝胶片经SybroRuby染色后激光扫描(BioRad)获取图象，图象输入PDQuest(8.0)分析软件后对各蛋白点进行点匹配、标准化处理和数据分析等以计算各蛋白点表达量差异，通过质谱（MALDI-TOFMS）鉴定蛋白质种类。结果表明：发生坏死性肠炎的肠道组织较之健康组织，其肠道组织坏死，黏膜绒毛和基底膜及固有层有脱落现象。蛋白质组学结果表明NEC发生时14种蛋白质发生了显著的变化，其中信号传递蛋白表达量(GNB2L1，Rack1和GDPdissociationinhibitor)分别提高了1.6和2.0倍(P＜0.05)，DNA合成抑制蛋白PHB和转铁蛋白（Serotransferrin）表达量分别在发生NEC的仔猪肠道组织提高了2.1和3.3倍(P＜0.05)；而结构蛋白(Actin，Keratin10)，代谢相关蛋白（FBCA，LDH，PCK,GlyRS和ETF-QO）和控制血液渗透压的血清球蛋白前体(Serumalbuminprecursor)表达量则下调了2-3倍(P＜0.01orP＜0.05)。小结：早产仔猪消化道发生坏死性肠炎时表现为肠道局部组织能量代谢紊乱、细胞膜骨架受损及细胞氧化损伤等，这一方面说明了发育不成熟的早产仔猪在NEC发生时肠道组织抵御外界应激因素的能力较发育成熟的肠道组织差，另一方面也暗示了NEC发生机理的复杂性。

目录

文摘

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第一部分 文献综述

1． 前言

2． 新生期哺乳动物的宫内发育迟缓

3． 新生仔猪消化道发育和功能

4． 宫内发育迟缓对新生哺乳动物消化道发育及功能的影响

5． 早期营养对新生哺乳动物消化道发育和功能的影响

6． 新生期哺乳动物坏死性肠炎

7． 哺乳动物肠上皮细胞的体外培养

8． 蛋白组学技术

9． 尚待研究的问题

10. 本研究的目的意义

11. 技术路线

第二部分 试验研究

试验一 宫内发育迟缓和营养对新生仔猪消化道生长发育及坏死性肠炎(NEC)发生率的影响

1． 材料与方法

2． 样品收集

3． 新生仔猪NEC评估

4． 肠黏膜刷状缘酶活性

5． 肠黏膜微生物粘附

6． 数据统计分析

7． 试验结果

8． 讨论

9． 小结

试验二 免疫应激对不同出生时间仔猪肠上皮细胞养分吸收功能和炎症因子基因表达的影响

1． 材料与方法

2． 考察指标

3． 数据统计分析

4． 试验结果

5． 讨论

6． 小结

试验三 新生仔猪消化道坏死性肠炎的蛋白组学研究

1． 试验材料

2． 试验设计

3． 蛋白组学技术检测NEC和健康组织差异表达蛋白质

4． 数据统计分析

5． 试验结果

6． 讨论

7． 小结

第三部分 全文讨论

第四部分 全文结论

1． 本研究的主要结论

2． 本研究的创新点

参考文献

攻读博士学位期间发表的主要学术论文

攻读博士学位期间参加的主要学术活动

致谢