黄粉虫幼虫抗菌肽诱导方法及其抗菌活性的研究

摘要

本试验选择黄粉虫幼虫(Tenebrio motitor Linnaeus)为研究材料，对抗菌肽的诱导因素、各因素的诱导水平、提取时间、多因素复合诱导以及对多种病原菌的抑菌效果、持续时间、抑菌机理等方面进行了研究，同时还进行了不同诱导因素所诱导的抗菌肽组分的电泳试验。为黄粉虫抗菌肽的开发与利用提供参考。试验结果如下：
　　 1.大肠杆菌、超声波与紫外光诱导处理后，黄粉虫幼虫都能产生不同抗菌活性的抗菌肽。试验以大肠杆菌作为指示菌，采用抑菌圈法测定黄粉虫幼虫抗菌肽的活性。结果表明，经3种诱导因素在5个水平下处理后，黄粉虫幼虫抗菌物质的活性随各因素诱导水平的升高而增大，产抗菌肽的时间动态都呈现先增加再下降的变化趋势，峰值出现在诱导后3-5d。不同诱导源诱导结果有所不同，经大肠杆菌诱导后，峰值随诱导浓度的增大而提前，超声波与紫外光诱导后峰值出现时间基本无变化。3个诱导因素处理后，黄粉虫幼虫的死亡率都随诱导水平的增大而增加。
　　 2.采用3因素5水平的正交旋转组合设计，以大肠杆菌浓度、超声波处理时间、紫外光处理时间为参试因素，黄粉虫幼虫抗菌肽产率（抑菌圈直径×存活率）为目标函数，得到拟合度较好的二次回归方程：Y=2.0611-2.4559×10-19×Z12+1.6524×10-3×Z22+3.0030×10-3×Z32+1.2776×10-9×Z1-6.5769×10-2×Z2-7.174910-2×Z3-3.2568×10-11×Z1Z2-3.2087×10-11×Z1Z3，F检验表明，大肠杆菌浓度对抗菌活性有极显著影响，超声波与紫外光则无显著影响。诱导方法优化组合方案为：大肠杆菌诱导浓度1.47-4.06×108个/mL，超声波处理时间18.3-21.8min，紫外光处理时间10.7-13.6min。
　　 3.电泳试验结果表明，与未处理的血淋巴样品相比，经大肠杆菌、超声波与紫外光诱导后，黄粉虫幼虫血淋巴在18、21、24与90KD处增加条带，55与36KD条带变浓，70KD条带变淡，不同诱导源诱导后的蛋白质条带变化基本一致。
　　 4.本试验选择了8种病原菌测定黄粉虫幼虫抗菌肽的抑菌谱，2种革兰氏阳性细菌中，黄粉虫幼虫抗菌肽只对链球菌有杀菌与抑菌效果，对金黄色葡萄球菌无明显的抑菌效果。6种革兰氏阴性细菌中，黄粉虫幼虫抗菌肽对大肠杆菌、嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、番茄青枯病菌均有杀菌与抑菌效果；对水稻白叶枯病主要为抑菌效果；对铜绿假单胞菌无显著的抑菌效果。结果表明：黄粉虫幼虫抗菌肽具有较广泛的抗菌谱，但对个别细菌无明显的抑菌效果。

目录

文摘

英文文摘

前言

1．文献综述

1.1 昆虫的免疫系统和功能

1.1.1 昆虫的细胞免疫

1.1.2 昆虫的非细胞免疫

1.2 抗菌肽的研究

1.2.1 抗菌肽的诱导与分离纯化

1.2.2 抗菌肽的分类及功能

1.2.3 抗菌肽的生物活性

1.2.4 抗菌肽生物活性的检测

1.3 黄粉虫抗菌肽的研究

2．研究目的及意义

3．试验材料与方法

3.1 试虫、菌株、培养基及缓冲液

3.2 试验主要仪器与药品

3.2.1 主要仪器

3.2.2 药品

3.3 技术路线

3.4 诱导源的选择与处理水平

3.4.1 单因素诱导

3.4.2 复合诱导

3.5 诱导方法

3.5.1 单一诱导源诱导方法

3.5.2 复合诱导

3.6 抗菌肽的收集和抑菌试验

3.6.1 抗菌肽收集

3.6.2 抑菌试验

3.7 三种诱导源诱导产生抗菌肽的电泳试验

3.8 对8种病原菌的抑菌效果测定

3.9 对8种病原菌抑菌持续时间的试验

4．结果与分析

4.1 大肠杆菌不同浓度处理的诱导效果

4.1.1 大肠杆菌诱导处理后各处理组内与组间抑菌圈直径的多重比较

4.1.2 大肠杆菌不同浓度诱导黄粉虫幼虫产生抗菌物质的时间动态

4.1.3 大肠杆菌不同浓度诱导黄粉虫幼虫校正死亡率的比较

4.2 超声波不同时间处理的诱导效果

4.2.1 超声波诱导后各处理组内与组间抑菌圈直径的多重比较

4.2.2 超声波不同时间诱导黄粉虫幼虫产生抗菌物质的时间动态

4.2.3 超声波不同时间诱导黄粉虫幼虫校正死亡率的比较

4.3 紫外光不同时间处理的诱导效果

4.3.1 紫外光诱导后各处理组内与组间抑菌圈直径的多重比较

4.3.2 紫外光不同时间诱导黄粉虫幼虫产生抗菌物质的时间动态

4.3.3 紫外光不同时间诱导黄粉虫幼虫校正死亡率的比较

4.4 单因素诱导源的比较

4.5 复合诱导效果

4.5.1 抗菌肽活性的主因子效应

4.5.2 影响抗菌活性的双因子互作效应

4.5.3 高抗菌活性各因素的频数统计分析

4.6 三种诱导源诱导产生抗菌肽的电泳试验分析

4.7 对8种病原菌抑菌效果的测定

4.8 对8种病原菌抑菌持续时间的分析

4.8.1 抗菌液对大肠杆菌的抑菌持续时间的分析

4.8.2 抗菌液对金黄色葡萄球菌的抑菌持续时间的分析

4.8.3 抗菌液对嗜水气单胞菌的抑菌持续时间的分析

4.8.4 抗菌液对枯草芽孢杆菌的抑菌持续时间的分析

4.8.5 抗菌液对链球菌的抑菌持续时间的分析

4.8.6 抗菌液对铜绿假单胞菌的抑菌持续时间的分析

4.8.7 抗菌液对水稻白叶枯病抑菌持续时间的分析

4.8.8 抗菌液对番茄青枯病菌抑菌持续时间的分析

5．结论与讨论

5.1 不同诱导源的诱导效果与最佳的诱导方法

5.2 黄粉虫幼虫血淋巴抗菌液的抑菌效果

5.3 黄粉虫幼虫血淋巴抗菌液的电泳试验

参考文献

致谢

附图