四川省雅江县松茸生长地土壤微生物多样性研究

摘要

从四川省雅江县4个不同海拔松茸生长地采集A、B层土壤8份，测定了土壤微生物量碳氮，酸性磷酸酶、脲酶、过氧化氢酶活性，可培养微生物数量；对分离获得的40株纯培养细菌，采用BOXAIR-PCR、16S rDNA PCR-RFLP、16S rRNA基因全序列分析，研究了其遗传多样性和系统发育及分类地位；进而采用PCR-DGGE方法研究了供试土样中细菌、真菌的多样性。其结果如下：
　　 1.供试土样微生物量碳在132.07mg/kg～371.95mg/kg之间，微生物量氮含量在14.15～53.88mg/kg之间。
　　 2.供试土样酸性磷酸酶含量在0.0938～0.3052mg·g-1·h-1之间，脲酶含量在0.0586～0.2252mg·g-1·h-1之间，过氧化氢酶含量为0.0229～0.0355mg·g-1·h-1。三种酶在土壤剖面中垂直分布有明显的层次性，多随土层加深而递减。
　　 3.供试土样中可培养微生物的数量：细菌为3.13×105cfu·g-1～3.76×107cfu·g-1，放线菌为0～3.00×106cfu·g-1,真菌数量为4.6×104cfu·g-1～1.40×106cfu·g-1。分离纯化得到40株纯培养细菌菌株，19株为G+，21株为G-菌株。
　　 4.对40株细菌的BOXAIR-PCR指纹图谱进行了聚类分析结果显示，在65％的相似水平上所有菌株聚在一起，在74％的相似水平上分为6个遗传群；16S rDNAPCR-RFLP聚类分析显示供试菌株在65％相似水平处，被分为G+和G-两大类，在74％的相似水平上被划分为7个群。
　　 5.选取了11个纯培养细菌测序，初步明确了其系统发育地位。11个代表菌株分别位于11个系统发育分支上，分属于芽孢杆菌属(Bacillus)，Lysinibacillus属，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，两面神菌属(Janibacter)，枝动菌属(Mycoplana)，Collimonas属，贪噬菌属(Var iovorax)，寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，假单胞菌属(Pseudomonas)，噬冷杆菌属(Psychrobacter)，土地杆菌属(Pedobacter)。
　　 6.对供试土样的细菌总DNA分析得到了清晰的DGGE图谱，多样性丰富。选取10根DGGE条带克隆测序后显示：代表优势菌群中有1个属于放线菌门、2个属于酸杆菌门、2个属于变形菌门，其余5个属于未分类细菌。
　　 7.真菌DGGE图谱条带数目多且亮度很高，不同采样点与不同土壤层次间差异较大。选取了11根条带作为真菌克隆测序对象并建立了系统发育树，结果显示：11个供试菌株分属于8个分支，在供试土样真菌中尤以盘菌亚门真菌为多。

目录

文摘

英文文摘

项目基金资助

1. 文献综述

1.1 概述

1.2 松茸研究现状

1.2.1 松茸药用价值研究

1.2.2 松茸生境研究

1.2.3 松茸菌丝分离培养研究

1.2.4 松茸人工栽培研究

1.2.5 松茸发生地土壤微生物研究

1.3 微生物多样性研究

1.3.1. 传统的微生物培养法

1.3.2 土壤微生物量和土壤酶

1.3.3. 生物标记物法

1.3.4 BIOLOG鉴定系统

1.3.5 分子生物学方法

1.4 立题依据与研究意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 供试土样

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂

2.2 方法

2.2.1 土壤理化性质的测定

2.2.2 土壤酶活性及微生物量碳氮的测定

2.2.3 菌种分离纯化与测数

2.2.4 供试菌株遗传多样性分析

2.2.5 土壤PCR-DGGE

2.2.6 数据处理及分析

3. 结果与分析

3.1 供试土样的理化性质

3.2 土壤酶活性及微生物量碳氮

3.3 微生物数量及分布

3.4 供试细菌形态特征

3.5 BOXAIR-PCR指纹图谱分析

3.5.1 BOXAIR-PCR电泳图分析

3.5.2 BOXAIR-PCR指纹图谱聚类分析

3.6 16S RRNA PCR-RFLP分析

3.6.1 16S rRNA扩增

3.6.2 16S rDNA酶切结果

3.6.3 细菌16S rRNA PCR-RFLP分析

3.7 16S RDNA基因序列分析

3.8 供试土样PCR-DGGE结果分析

3.8.1 土壤细菌PCR-DGGE分析

3.8.2 土壤真菌PCR-DGGE分析

4 讨论与结论

4.1 讨论

4.1.1 土壤微生物量与土壤酶活

4.1.2 土壤可培养微生物数量测定

4.1.3 供试细菌菌株的鉴定

4.1.4 PCR-DGGE

4.2 结论

参考文献:

致谢

附录1 供试细菌菌株与标准菌株全序列的相似性(%)

附录2 细菌PCR-DGGE条带序列与参比菌株全序列的相似性(%)

附录3 真菌PCR-DGGE条带序列与参比菌株全序列的相似性(%)

附录4： 供试细菌16SrDNA基因序列

附录5： 细菌PCR-DGGE条带基因序列

附录6： 真菌PCR-DGGE条带基因序列