与辣(甜)椒抗根结线虫Mel基因紧密连锁的EST-SSR分子标记的开发

摘要

根结线虫是辣(甜)椒的主要病害之一，其危害日趋严重。培育抗性品种是防治根结线虫最有效的方法，常规育种周期长、消耗大，利用分子标记辅助育种则会大大提高育种速度。EST-SSR作为一种新型分子标记，来自表达基因，除具备传统基因组来源的SSR标记所有优势外，还可能与基因功能具有直接或间接关系，从而强化了SSR标记在遗传研究中的应用。
　　 本研究以辣椒EST数据为基础，通过分析辣椒EST-SSR位点信息，建立了部分辣椒EST-SSR标记，并开发与辣椒抗根结线虫显性单基因Me1紧密连锁的分子标记，为Me1基因的标记辅助选择奠定基础。主要研究结果如下：
　　 1.利用SSRIT软件(http://www.gramene.org/gremene/searches/ ssrtool)从NCBl(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)数据库中19173条辣椒EST序列中筛选到612个SSR，检出率为3.19％。共观察到51种重复基元，其中三核苷酸基序是主导类型，占总SSR的60.46％:AG/GA/CT/TC,AAG/AGA/GAA/CTT/TTC/TCT,TAAT,ATATA和CTGCTC分别是二、三、四、五和六核苷酸基序的优势重复基序，在所有SSR中的出现频率各自为13.40％、16.18％、1.80％、3.27％及2.12％。辣椒EST-SSR以5-10次重复为主，基序长度集中在15-20bp范围内。
　　 2.利用筛选出含SSR的576条EST序列，设计了357对引物，在合适的PCR条件下，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶银染检测这些引物在6个辣(甜)椒品种中的扩增情况和多态性。其中有337对引物显示出清晰条带，引物有效扩增率为94.40％;75对引物表现多态性，占有效扩增引物的21.01％。
　　 3.用含抗根结线虫病基因Me1的PM217与典型感线虫品种茄门，及其F1、F2代为试材，采用南方根结线虫(Meloidogyne spp.)人工接种鉴定，每株接种2000卵，两个月后进行抗病性鉴定，根据鉴定结果，利用分离群体分组分析法(bulked segregantanalysis，BSA)建立抗感池，共筛选到4对(118、141、142及211)多态性EST-SSR引物在抗感池间存在差异，分别将该4个标记位点暂命名为118、141、142及211。
　　 4.利用Joinmap3.0软件，结合抗病性鉴定，对271个单株的F2群体进行SSR分析，研究4个EST-SSR标记位点与根结线虫抗性基因Mel的连锁关系，结果表明，EST-SSR标记141、118及211与Mel连锁程度较高，遗传距离分别为6.984cM、18.684 cM和29.310cM。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

1 引言

1.1 辣椒根结线虫病研究现状

1.1.1 根结线虫及其危害

1.1.2 致病机理

1.1.3 防治方法

1.2 遗传标记技术的发展

1.2.1 遗传标记概述

1.2.2 DNA分子标记的发展

1.2.3 表达序列标签(EST)及EST-SSR标记的研究进展

1.2.4 筛选分子标记的方法

1.3 分子标记在辣(甜)椒遗传育种上的应用

1.3.1 资源分类及遗传多样性研究

1.3.2 遗传图谱的构建

1.3.3 基因定位

1.3.4 品种纯度鉴定

1.3.5 辅助育种

1.3.6 展望

1.4 辣(甜)椒根结线虫抗性育种研究进展

1.4.1 辣椒抗根结线虫基因

1.4.2 常规育种

1.4.3 分子辅助育种

1.5 本研究的目的和意义

2 辣(甜)椒EST-SSR信息分析及标记开发

2.1 材料与试剂

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 材料制备及模板DNA提取

2.2.2 SSR-PCR扩增

2.2.3 扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测

2.2.4 银染程序

2.2.5 辣椒EST-SSR筛选

2.3 结果与分析

2.3.1 模板DNA提取

2.3.2 SSR-PCR体系优化

2.3.3 辣椒EST-SSR位点信息

2.4 讨论

2.4.1 PCR反应体系优化

2.4.2 辣椒EST-SSR特点

2.4.3 辣椒EST-SSR的可用性评价

2.4.4 所筛得的EST-SSR标记在遗传育种中的意义

3 与抗根结线虫基因Me1紧密连锁的EST-SSR标记开发

3.1 材料与试剂

3.1.1 实验材料

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 实验方法

3.2.1 材料准备

3.2.2 病根采集

3.2.3 苗期人工接种根结线虫

3.2.4 模板DNA的提取

3.2.5 BSA分池

3.2.6 EST-SSR分析

3.2.7 SSR扩增反应

3.2.8 引物筛选

3.2.9 扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测及银染

3.2.10 带型统计

3.2.11 连锁分析

3.3 结果与分析

3.3.1 辣椒抗根结线虫接种鉴定结果

3.3.2 基因组DNA提取与检测

3.3.3 亲本与抗感池间多态性引物筛选

3.3.4 与辣椒抗根结线虫Me1基因连锁EST-SSR标记筛选

3.4 讨论

3.4.1 辣椒抗根结线虫基因遗传研究

3.4.2 F2代分离群体用于分子检测的可靠性

3.4.3 辣椒抗RKN的抗性鉴定技术

3.4.4 BSA法的选择应用

3.4.5 EST-SSR标记的准确性分析

4 结论

参考文献

致谢

附录

附图：

攻读学位期间发表的学术论文