齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)FSHβ亚基与LHβ亚基cDNA全序列克隆及生物信息学分析

摘要

促性腺激素(GTH)是由脊椎动物脑垂体前叶细胞合成和分泌的一类糖蛋白激素，主要生理作用是刺激生殖细胞的生长、发育、成熟，正常的排精及排卵。鱼类盼促性腺激素GTHⅠ和GTHⅡ分别对应着哺乳动物当中的促卵泡素(FSH)和黄体生成素(LH)。促性腺激素是由α和β两个亚基组成，以非共价键相连接形成二聚体结构，其中α亚基氨基酸组成相同，而β亚基的氨基酸组成则明显不同，具有特异的生物学作用。因此研究FSH[3亚基和LHβ亚基的结构和功能将有助于了解畜禽、鱼类生殖生理状况，为进一步提高动物繁殖效率、挖掘动物繁殖潜能等具有重要的意义。
　　 本研究选用齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)为实验材料，从齐口裂腹鱼脑垂体中提取总RNA。设计针对齐口裂腹鱼FSHβ亚基、LHβ亚基基因的特异性引物，通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆得到齐口裂腹鱼的cDNA全序列，并对序列进行相关分析。
　　 结果显示：(1)齐口裂腹鱼FSHβ亚基cDNA全序列长度为624bp，编码区(CDS)序列长度为393bp，编码130个氨基酸；LHβ亚基cDNA全序列长度为640bp，编码区(CDS)序列长度为441bp，编码146个氨基酸。生物信息学分析显示，齐口裂腹鱼FSHβ亚基是一个具有1个跨膜螺旋和3个主要疏水区域的带负电荷的蛋白，分子量为14.5lkDa，pI为5.28。其氨基酸序列具有12个磷酸化位点；LHβ亚基同样也是一个具有1个跨膜螺旋和4个主要疏水区域的带负电荷的蛋白，分子量为16.34kDa,pI为4.98。其氨基酸序列具有11个磷酸化位点。(2)齐口裂腹鱼与其它脊椎动物，包括哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类等不同物种的两个基因编码氨基酸同源性比较分析表明：FSHβ亚基与鲤形目中鲤鱼的同源性最高，达到96.9％，与两栖类中日本蟾蜍的同源性最低为37.6％；LHβ亚基同源性与鲤鱼最高，达到93.1％，与人类最低为43.2％。核苷酸同源性比较显示：齐口裂腹鱼FSHβ亚基与鲤鱼的同源性最高达到96.2％，与两栖类的日本蟾蜍最低为46.9％；LHβ亚基同样与鲤鱼的同源性最高为95.8％，与鸟类的日本鹌鹑最低为50.5％。这一结果初步可以确定克隆所得到的两段序列为齐口裂腹鱼的FSHβ亚基和LHβ亚基。(3)利用MAGA4.0根据22种脊椎动物的氨基酸序列构建NJ系统树和MP系统树表明：齐口裂腹鱼属于鲤形目，与鲤鱼、草鱼、青鱼形成聚类，与传统分类学保持一致，通过相似性比对、遗传距离及系统分支程度显示FSHβ亚基进化速率相对保守，LHβ亚基在鸟类、爬行类、哺乳类中进化比其他脊椎动物快。可以揭示两种糖蛋白基因的进化伴随物种进化而显示其功能。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

1 文献综述

1.1 促性腺激素结构和功能

1.2 鱼类促性腺激素研究概况

1.3 齐口裂腹鱼生物学特征及研究概况

1.4 生物信息学在基因克隆和序列分析中的应用

1.4.1 生物信息学的产生和发展

1.4.2 针对基因序列的预测

1.4.3 针对蛋白质结构的预测

1.5 cDNA末端快速扩增技术(RACE)

1.6 本研究内容和意义

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 样本的采集

2.1.2 主要仪器设备

2.1.3 实验试剂

2.1.4 主要试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 引物的设计

2.2.2 总RNA的提取

2.2.3 总RNA的纯化

2.2.4 总RNA的检测

2.2.5 PCR产物的分离、回收、纯化及测序

2.2.6 RACE技术克隆齐口裂腹鱼的FSHβ与LHβ亚基cDNA全序列

2.2.7 FSHβ与LHβ亚基cDNA全序列的拼接

2.2.8 序列分析与进化树的构建

3 结果与分析

3.1 PCR扩增及克隆测序结果

3.1.1 总RNA提取结果

3.1.2 齐口裂腹鱼FSHβ与　LHβ亚基cDNA片断PCR结果

3.2 齐口裂腹鱼FSHβ与LHβ亚基3'-,5’-RACE结果

3.3 齐口裂腹鱼FSHβ与LHβ亚基cDNA全序列分析

3.3.1 齐口裂腹鱼FSHβ亚基cDNA全序列分析

3.3.2 齐口裂腹鱼LHβ亚基cDNA全序列分析

3.4 齐口裂腹鱼及其它脊椎动物FSHβ与LHβ亚基氨基酸性质

3.4.1 FSHβ与LHβ亚基氨基酸基本性质

3.4.2 齐口裂腹鱼FSHβ与LHβ亚基蛋白质跨膜结构分析

3.4.3 齐口裂腹鱼FSHβ与LHβ亚基N-糖基化位点预测

3.4.4 齐口裂腹鱼FSHβ与LHβ亚基蛋白质二级结构的预测

3.5 齐口裂腹鱼FSH[3与LHβ亚基与其他物种同源氨基酸序列比对

3.6 齐口裂腹鱼FSHβ与LHβ亚基与其他物种在核苷酸和氨基酸水平上同源性比较

3.7 FSHβ与LHβ亚基进化树的构建

4 讨论

4.1 实验材料的选择

4.2 RACE技术在扩增全序列中的应用

4.3 齐口裂腹鱼FSHβ亚基序列特征

4.4 齐口裂腹鱼LHβ亚基序列特征　　　

4.5 齐口裂腹鱼FSHβ亚基与LHβ亚基功能的预测

4.6 促性腺激素(GTH)进化

4.7 系统进化树

5 结论

参考文献

致谢