牛抵抗素基因的真核表达及生物学活性鉴定

摘要

抵抗素是一种由白色脂肪组织的脂肪细胞分泌的新型小分子蛋白，是联系肥胖和2型糖尿病的纽带，可减弱脂肪细胞、骨骼肌细胞、肝细胞胰岛素的敏感性。国内外，抵抗素引起胰岛素抵抗的研究主要集中在小鼠和人，且机制研究尚无一致结论。而牛抵抗素与胰岛素抵抗的关系研究少之又少，已有牛抵抗素基因的原核表达、酮病牛抵抗素基因的真核表达的相关报道。但抵抗素基因真核表达产物有无活性，尚未见报道。
　　 本研究分别进行了牛抵抗素基因克隆、真核表达及表达产物生物学活性研究，为临床治疗动物糖代谢紊乱性疾病提供了科学依据。
　　 试验从18月龄牛腹部脂肪组织中提取总RNA、反转录及PCR扩增，凝胶电泳鉴定后连接T载体，再进行PCR和双酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序。结果用RT-PCR扩增获得了343bp的牛抵抗素基因的cDNA编码序列；成功将牛抵抗素基因克隆至pMD18-T载体上，构建了pMD-Res重组克隆质粒；所获得的目的基因大小为343bp，与Genbank中牛抵抗素基因的序列同源性为99％，表明所获得的基因为牛抵抗素编码基因。
　　 设计真核表达引物，进行PCR扩增，连接T载体，进行双酶切鉴定后连接真核表达载体pPICZaA，进行PCR和双酶切鉴定后测序。然后将成功构建的真核表达质粒线性化，转到酵母中进行基因重组，经表型和PCR双重筛选后进行表达条件的优化，进行酵母工程菌的增量表达，应用Dot-blot、SDS-PAGE和western-blot鉴定，浓缩纯化，得到纯化蛋白。试验结果表明成功构建出了牛抵抗素基因真核表达质粒(pPICZaA-resistin);经过表型筛选和PCR筛选，得到5株整合成功的菌株；牛抵抗素真核表达体系的条件优化是甲醇浓度1.0％、表达时间72h，提高了蛋白表达量；经过Dot-blot筛选，得到1株特别好的重组酵母表达菌株；成功表达出牛抵抗素蛋白，分子量为14KD，并获得重组牛抵抗素蛋白。
　　 试验选取体重相似(约100±10g)的4周龄wistar大鼠20只，随机分成4组，每组5只。第1组(自由进食，注射不含重组牛抵抗素的PBS)、第Ⅱ组(自由进食，注射含1：1重组牛抵抗素的PBS)、第Ⅲ组(禁食2d，注射不含重组牛抵抗素的PBS)、第Ⅳ组(禁食2d，注射含1:1重组牛抵抗素的PBS)。四个组均在Ⅲ、Ⅳ组小鼠开始禁食时，均同时注射上述药物(每次1.5mg/只，每隔12h注射一次，连续注射4次)。在最后一次注射(48h时)后，立即尾静脉采血记为(0min)，以后在15min、30min、60min、120min和180min分别采集全血，检测血糖和胰岛素含量。实验结果表明重组牛抵抗素不论对自由进食或禁食2d大鼠的血糖浓度和胰岛素水平均具明显提高作用，说明重组牛抵抗素具有明显的生物学活性。
　　 取培养良好的肝细胞培养板(6孔板)，每孔分别接种重组牛抵抗素0、10、50、100、300、500ng/L(共6个梯度，共6个重复)，继续培养12h，PBS洗涤细胞，然后超声破碎，收集上清，采用考马斯亮蓝染色法测定上清液中牛抵抗素蛋白的含量。每管上清中取出100μl加入基质缓冲液37℃恒温水浴8min，加入1.5mmol/L的草酰乙酸100μl，在酶标仪上读取340nm处的吸光度，根据蛋白含量及吸光度计算PEPCK酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)的比活性。结果表明PEPCK酶活性随重组牛抵抗素浓度的升高而增强，10ng/L以上的重组牛抵抗素可明显提高PEPCK活性，再次证明重组牛抵抗素具有明显的生物学活性。
　　 综上所述，本研究成功地克隆了牛抵抗素基因，成功构建出了牛抵抗素基因的真核表达质粒，表达产物(重组牛抵抗素蛋白)具有明显的生物学活性。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写词

第一部分 文献综述

1 抵抗素基因及分子结构

2 抵抗素的分布表达和影响因素

3 抵抗素的作用机制

3.1 肝脏内胰岛素抵抗

3.2 脂肪组织内胰岛素抵抗

3.3 骨骼肌中胰岛素抵抗

4 抵抗素的生物学效应

4.1 抵抗素与胰岛素抵抗

4.2 抵抗素与肥胖的关系

4.3 抵抗素与糖尿病的关系

4.4 抵抗素与高血压的关系

4.5 抵抗素与动脉粥样硬化

4.6 抵抗素与脑梗死

4.7 抵抗素与炎症因子

4.8 抵抗素与内皮细胞的关系

4.9 抵抗素与脂肪组织代谢的关系

4.10 抵抗素与其他脂肪因子

4.11 抵抗素与肝组织的关系

5 抵抗素基因研究进展

6 研究目的意义

第二部分 试验内容

实验一 牛抵抗素基因的克隆

1 试验材料

2 抵抗素引物的设计与合成

3 试验方法

4 讨论

5 小结

实验二 牛抵抗素基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

1 试验材料

2 主要试验设备与试剂

3 所用培养基和缓冲液的配制

4 牛抵抗素基因真核表达载体的构建

5 牛抵抗素基因在酵母中表达

6 酵母中表达的重组牛抵抗素目的蛋白的鉴定

7 目的蛋白的纯化

8 讨论

9 小结

实验三 重组牛抵抗素生物学活性的鉴定

1 试验材料

2 试验内容

3 讨论

4 小结

研究结论

参考文献

致谢