鹅SCD1基因全长cDNA的克隆、组织表达及填饲对其表达的影响

摘要

硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)是催化单不饱和脂肪酸合成的限速酶,同时也是甘油三酯、磷脂和胆固醇等合成的关键酶。靶向敲除SCD1基因的小鼠表现为消瘦且抑制食物诱导的肝脂肪变性，但SCD1是否在鹅肥肝形成中起着重要作用，尚未见报道。本研究以四川白鹅和朗德鹅为材料，从所构建的抑制消减杂交文库中筛选出SCD1基因的部分EST，以此为基础，通过5′-RACE和3′-RACE技术，首次扩增出了鹅SCD1基因cDNA的全长序列，应用生物信息学知识进行了序列分析，实时荧光定量PCR检测了SCD1在鹅各个组织中的表达情况及填饲对其在肝脏中的表达影响。得到如下研究结果：
　　 (1)鹅SCD1基因的cDNA序列全长为1228bp，其中包含29bp5′-UTR，一个1074bp编码357个氨基酸的开放阅读框和125bp3′-UTR。
　　 (2)分子进化树构建发现，鹅SCD1与其它物种高度保守，特别是与原鸡和斑胸草雀的同源性高达94％。
　　 (3)保守结构域分析发现，鹅SCD1的氨基酸序列跟其它物种一样，包含4个跨膜结构域和两个Delta9-FADS-likes结构；同时，具有三个保守的组氨酸结构域，且存在多个半胱氨酸位点。
　　 (4)实时定量PCR测得鹅的SCD1 mRNA的表达具有组织特异性，主要表达于肝脏、腹脂和皮质，而在其他组织表达极低。
　　 (5)填饲引起SCD1基因在四川白鹅和朗德鹅肝脏中的表达显著增加，其增加幅度与肝脏甘油三酯、血浆胰岛素水平和血浆极低密度脂蛋白(VLDL)显著正相关，表明SCD1基因的表达与鹅肥肝的形成具有密切的关系。

目录

文摘

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符号说明

前言

1 文献综述

1.1 SCD基因的结构和组织分布特点

1.2 SCD1的化学结构与生理功能

1.3 SCD1在脂肪代谢中的作用

1.3.1 SCD1在脂肪酸合成中的作用

1.3.2 SCD1在脂蛋白分泌中的作用

1.3.3 SCD1在脂肪酸氧化中的作用

1.4 RACE技术的应用与展望

1.5 本实验的目的与意义

2．材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验动物来源

2.1.2 鹅的饲养管理

2.1.3 样品的采集

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 试验试剂

2.1.6 主要试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 SSH文库中筛选鹅SCD1基因的EST

2.2.2 差异表达EST生物信息学分析

2.2.3 SCD1基因全长cDNA克隆

2.2.4 生物信息学的分析

2.2.5 SCD1基因在四川白鹅各组织中的表达

2.2.6 填饲后鹅肥肝中血浆参数检测

3 结果与分析

3.1 RACE技术获得SCD1基因全长

3.1.1 从SSH文库中筛选鹅SCD1基因的EST

3.1.2 3’-RACE结果与分析

3.1.3 5’-RACE结果与分析

3.1.4 全长SCD1基因的拼接与鉴定

3.2 氨基酸水平上的分析

3.2.1 系统进化分析

3.2.2 氨基酸组成

3.2.3 疏水性分析

3.2.4 保守结构域分析

3.2.5 SCD1蛋白质跨膜螺旋特征

3.2.6 半胱氨酸位点及组氨酸结构域分析

3.3 蛋白质高级结构预测

3.4 SCD1的组织表达特性

3.5 填饲后鹅肥肝中相关指标的检测

3.5.1 不同品种鹅肝脏中SCD1基因mRNA表达丰度

3.5.2 相关分析

4．讨论

4.1 RACE实验注意事项

4.1.1 目标基因的丰度对RACE的影响

4.1.2 引物特异性对RACE的影响

4.2 SCD1基因cDNA全长克隆及生物信息学分析

4.3 SCD1基因的组织表达特性

4.4 SCD1基因在填饲鹅肝脏脂质合成中的作用

4.5 SCD1基因在填饲鹅肝脏脂质分泌中的作用

5 结论

参考文献

致谢