山羊化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性试验

摘要

化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)常引起牛、羊、猪等动物的化脓性感染，主要表现为肺炎、关节炎、心内膜炎、乳腺炎、皮下脓肿等，对畜牧业可造成很大的危害。近年来国内外在猪、牛、犬以及野生动物体内多有分离化脓隐秘杆菌的报道。本研究进行了山羊化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性等试验研究。
　　 一、山羊化脓隐秘杆菌的分离鉴定
　　 无菌取病羊的肺脏接种鲜血培养基，分别进行厌氧培养和需氧培养，培养温度均为37℃。厌氧培养和需氧培养48h后，鲜血培养基上均长出1～2mm、圆形、无色、表面凸起、边缘整齐、露滴状菌落；该菌具有β-溶血特性，为兼性厌氧菌；对分离菌进行革兰氏、美兰染色及荚膜、芽孢、鞭毛染色。该菌为革兰氏阳性、不运动、无荚膜、无芽孢的小杆菌，形态不均一，多单在或成对尤其呈“V”字形或呈丛出现，美兰着色不良：对分离菌进行最适培养基筛选，结果为该菌在营养肉汤和营养琼脂中生长贫瘠，在血清肉汤、血清琼脂中生长良好，厌氧培养生长更迅速；该菌能发酵葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖等产酸不产气，不能发酵棉子糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、卫矛醇、鼠李糖等。MR试验、明胶液化试验为阳性，吲哚试验、硫化氢试验、VP试验、硝酸盐还原试验、触酶试验为阴性，能酸凝胨化牛奶，生化试验结果与化脓隐秘杆菌的生化特性一致；对该菌进行16s rRNA序列分析，结果与Genebank中化脓隐秘杆菌的同源性为99％，该序列已被Genebank收录，登录号为HM246725。本试验成功分离出一株山羊化脓隐秘杆菌，命名为SC-1株。
　　 二、山羊化脓隐秘杆菌的致病性试验
　　 取适量山羊化脓隐秘杆菌菌液（约7.9×108cfu/0.3ml），等量无菌生理盐水洗涤3次，按0.3ml/只腹腔注射10只小鼠。结果剂量为7.9×108cfu/0.3ml的山羊化脓隐秘杆菌在72h内全部致死小鼠，病死小鼠的肝、肺化脓肿大，脾脏淤血，心外膜有出血点，肾、脑无明显病变，并从死亡小鼠的心、肝、脾、肺、肾中分离出该菌。组织病理结果表明，心、肝、脾、肺、肾出现不同程度的病理变化；取适量该菌菌液，反复洗涤三次，适量无菌生理盐水重悬（约7.9×108cfu/0.3ml），反复冻融3次，超声波破碎菌体过滤除菌，滤液按0.5ml/只尾静脉注射5只小鼠，连续观察15d5只小鼠均健活；取适量该菌菌液（约7.9×108cfu/0.3ml），过滤除菌，滤液按0.5ml/只尾静脉注射5只小鼠。结果滤液能在48～72h内全部致死小鼠；对这株山羊化脓隐秘杆菌进行溶血素基因(PLO)的PCR扩增。结果成功扩增出PLO溶血素基因，大小为270bp;试验结果表明，山羊化脓隐秘杆菌SC-1株对小鼠具有致死性，外毒素是其主要致病因子，内毒素无致病性或致病力不强，具有PLO溶血素基因。选取16种药物对该株山羊化脓隐秘杆菌杆菌进行药敏试验。该菌对青霉素、头孢噻肟、庆大霉素、四环素、利福平等高度敏感，对阿米卡星、新霉素、红霉素中度敏感，对阿奇霉素耐药。本试验对山羊化脓隐秘杆菌的致病性进行初步研究，为后续深入开展化脓隐秘杆菌的诊断、防控及致病机理等研究奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

1 文献综述

前言

1.1 病原学

1.2 流行病学

1.3 感染及危害

1.4 致病机理

1.4.1 致病因子

1.4 临床及解剖症状

1.4.1 临床症状

1.4.2 解剖症状

1.5 病理变化

1.6 诊断方法

1.6.1 微生物学诊断

1.6.2 16s rRNA PCR诊断

1.7 治疗与预防

1.7.1 治疗

1.7.2 预防及措施

1.8 国内外研究进展

2 本研究的目的和意义

第一章 山羊化脓隐秘杆菌的分离与鉴定

1 材料

1.1 病料

1.2 主要材料

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 化脓隐秘杆菌的分离培养

2.2 化脓隐秘杆菌的鉴定

3 结果

3.1 化脓隐秘杆菌的分离培养结果

3.2 化脓隐秘杆菌最适培养基筛选结果

3.3 化脓隐秘杆菌的鉴定结果

4 讨论

4.1 山羊化脓隐秘杆菌的分离

4.2 山羊化脓隐秘杆菌的生长及形态学特性

4.3 生化鉴定

4.4 16s rRNA PCR鉴定

第二章 山羊化脓隐秘杆菌对小鼠的致病性试验

1 材料

1.1 主要材料

1.2 主要仪器

1.3 试验动物

2 方法

2.1 小鼠攻毒试验

2.2 细菌内毒素致病性试验

2.3 细菌外毒致病性素试验

2.4 PCR扩增化脓隐秘杆菌PLO溶血素基因

2.5 药敏试验

3 试验结果

3.1 小鼠攻毒试验

3.2 细菌内毒素致病性试验结果

3.3 细菌外毒素致病性试验结果

3.4 PCR扩增结果

3.5 药敏试验

4 讨论

4.1 攻毒试验

4.2 内毒素试验

4.3 外毒素试验

5 结论

参考文献：

致谢

附录：