利用SSR鉴定观赏桃种质资源亲缘关系的研究

摘要

本研究采用SSR标记技术对来源于中国科学研究院郑州果树研究所的19个观赏桃品种和北京市农林科学院的3个观赏桃品种进行了亲缘关系分析。本文主要探讨了观赏桃的DNA提取方法，SSR-PCR的体系优化，银染技术，SSR引物的筛选以及22个观赏桃品种的亲缘关系分析。主要成果如下:
　　(1)实验技术体系构建
　　根据文献比较和实验验证，最终确定以刘燕(2011)的改良CTAB法进行总DNA的提取。采用L25(56)正交设计方案，确定25μl体系“模板DNA（20ng/μl）3μl，引物（10μM)1.0μl,Mg2+(25 mM)2.0μl,dNTPs(2.5 mM)3.0μl,TaqDNA聚合酶(2.5 U/μl)0.8μl，10×Buffer（free Mg2+）”作为SSR-PCR反应体系。通过文献比对和实验摸索，确定了银染方法:先用流水冲洗带凝胶的短玻璃板10秒钟，然后放置10％冰醋酸中固定30分钟，再用流水冲洗半秒钟，置于1‰染色AgNO320分钟，再用流水快速冲洗，最后放置于1.5％ NaOH和0.25％甲醛中显色。
　　(2)SSR引物筛选
　　从E Dirlewanger等人(2002)报道的41对SSR引物筛选出12对多态性高的单位点扩增引物。12对引物共扩增出44个多态性条带，多态性比例均为100％，每对引物扩增出2-5条多态性条带，平均每对引物扩增出3.7条多态性条带。
　　(3)22个观赏桃品种的亲缘关系分析
　　利用NT SYS2.10E软件进行聚类，分析结果表明，在相似系数为0.66时，22个观赏桃品种被聚为直枝型、矮化型和垂枝型3类。直枝型包括‘红叶碧桃，、‘报春’、‘洒红’、‘红绣球’、‘单粉’、‘春艳’、‘二色桃’、‘月季桃，、‘锦春，和‘贺春，;矮化型包括‘寿红’、‘红菊花’、‘菊花桃’、‘满山红’和‘满天红，;垂枝型包括:‘单瓣垂枝’、‘垂枝1’、‘垂枝2’、‘白重瓣垂枝’、‘朱粉垂枝2’、‘朱粉垂枝1，和‘红叶垂枝’。
　　结果支撑了把枝型作为比花型更高级的分类级别，同时花型、花色、叶色性状之间存在交叉，其中交叉程度最轻的是花型。本文供试的22个观赏桃可分别以枝型和花型为第一、二级分类标准进行大致分类。

目录

声明

摘要

缩略词及中英对照

前言

1 综述

1．1 观赏桃种质资源现状

1．1．1 观赏桃的起源与分布

1．1．2 有关观赏桃种质资源记载

1．2 分子标记种类及其特点

1．2．1 RFLP技术

1．2．2 RAPD技术

1．2．3 AFLP技术

1．2．4 SSR技术

1．3 分子标记在观赏桃种质资源研究上的应用

1．3．1 品种鉴定和分类

1．3．2 亲缘关系分析

1．3．3 遗传多样性分析

1．3．4 指纹图谱研究

1．4 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题

1．4．1 研究目标

1．4．2 研究内容

1．4．3 拟解决的关键问题

1．4．4 技术路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试剂和设备

2．2．1 总DNA提取

2．2．2 SSR-PCR扩增

2．2．3 电泳、EB染色和银染

2．2．4 主要仪器设备

2．3 试验方法

2．3．1 田间性状调查

2．3．2 总DNA的提取与检测

2．3．3 SSR-PCR反应体系的建立和优化

2．3．4 退火温度确定和SSR引物筛选

2．3．5 SSR扩增

2．3．6 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染

2．3．7 数据处理与分析

3 结果与分析

3．1 22个观赏桃品种的田间性状调查结果

3．2 总DNA的提取及检测

3．2．1 核酸蛋白仪检测

3．2．2 琼脂糖凝胶电泳检测

3．2．3 SSR-PCR预扩增检测

3．3 SSR-PCR反应体系的优化

3．3．1 模板DNA浓度对SSR-PCR扩增的影响

3．3．2 引物浓度对SSR-PCR扩增的影响

3．3．3 Mg2+浓度对SSR-PCR扩增的影响

3．3．4 dNTPs浓度对SSR-PCR扩增的影响

3．3．5 Taq DNA聚合酶浓度对SSR-PCR扩增的影晌

3．3．6 SSR-PCR扩增体系的建立

3．4 SSR引物筛选

3．5 22个观赏桃品种的亲缘关系分析

4 讨论与结论

4．1 DNA的提取

4．2 SSR-PCR的优化

4．3 电泳和银染

4．4 引物的筛选

4．5 桃花品种的分类

4．6 部分桃花品种的亲缘关系讨论

参考文献

致谢