贡嘎蝙蝠蛾粉拟青霉的遗传多样性及生物学特性研究

摘要

由粉拟青霉菌(Paecilomyces farinosus)引起的贡嘎蝙蝠蛾（Hepialus gonggaensis）拟青霉病是贡嘎蝙蝠蛾人工繁育过程中面临的主要病害之一。为明确贡嘎蝙蝠蛾拟青霉病的传播途径及病原变异，本文利用ISSR分子标记方法对82株采自不同虫态发育时期及其相应生长环境介质中的粉拟青霉菌株进行了遗传多样性研究和生物学特性差异研究，以期为有效控制蝙蝠蛾拟青霉病提供预测和防治依据。研究结果如下:
　　1.粉拟青霉菌遗传多样性分析
　　构建粉拟青霉菌ISSR-PCR扩增反应体系并进行粉拟青霉菌遗传多样性分析。以粉拟青霉菌的基因组DNA为模板，采用正交设计方法(L16(43))对ISSR-PCR反应体系中的引物、Taq酶、模板、PCR反应MIX混合液等4个重要参数进行了优化，初步建立了适合粉拟青霉菌的ISSR-PCR反应体系，即25μL PCR反应体系中，模板DNA70 ng、引物0.5μmol/L、PCR反应MIX混合液8μL、Taq酶1U。应用该优化体系从20个ISSR通用引物（由加拿大哥伦比亚大学公布）中筛选出10条带谱清晰、多态性高、稳定性好的引物，并对所有菌株基因组DNA进行ISSR-PCR扩增反应，10个引物共获得72个扩增位点，扩增片段大小在150-2000 bp之间;其中多态性位点数为46个，多态性百分率达63.9％。对扩增结果进行聚类分析，结果表明:供试的82株菌株之间存在丰富的遗传多态性，其遗传距离在0.561-0.912之间;在阈值为0.606处可以较明显地分为五组。
　　通过对从折多山冬虫夏草人工繁育基地的贡嘎蝙蝠蛾人工繁育基质、工具、室内空气、外界环境和废弃物中分离的粉拟青霉菌与从罹病虫体中分离的粉拟青霉菌进行ISSR分析发现，供试的82株粉拟青霉菌在ISSR聚类分析上表现不同的聚类关系，这说明多年长期集约化人工繁育贡嘎蝙蝠蛾，使得康定折多山冬虫夏草人工繁育基地的粉拟青霉菌存在丰富的遗传多样性，并与西藏林芝、甘肃玛曲、青海拉脊雪山、四川小金等冬虫夏草天然产地进行了充分的病原菌交流，培养基地的所有环境及介质都可成为贡嘎蝙蝠蛾发生拟青霉病的病原来源。试验中采自病虫体的粉拟青霉菌均与采自试验房（8号、9号、10号）、部分中央大厅和楼房南面外墙的菌株具有较高的同源性，这可以推断引起虫体发病的病源具有多元性;中央大厅和试验房（8号、9号、10号）可能是引起虫体发病的主病源，而楼房南面外墙是次病源;进一步说明了折多山冬虫夏草人工繁育基地半人工繁育贡嘎蝙蝠蛾发生拟青霉病的病菌来源的广泛性。
　　2.粉拟青霉菌生物学特性差异研究
　　根据遗传差异程度的不同，试验选用菌株2-J4-1、1-WQN-1、2-E2-2、2-M3-1、L-8、1-E10-1、2-G5、1-C6-2（编号依次为:13、20、22、33、54、58、68、82）做生物学特性差异研究，采用邓肯氏新复极差分析法进行数据分析与处理。试验结果如下:各粉拟青霉菌株对温度的适应范围较广，在5℃-30℃温度范围内都可以正常生长，10℃-25℃条件下可以正常产孢;生长最适温度为20℃-25℃，产孢最适温度为20℃;试验所有菌株在pH4-pH12均可以生长，大部分菌株在pH值为7时生长最快，产孢最多，极显著差异于其他pH处理;黑暗条件下各粉拟青霉菌菌落生长最快，随着光照的增加生长减慢;碳源有利于各粉拟青霉菌株的生长，在含有葡萄糖、乳糖和淀粉的培养基中生长的粉拟青霉菌均比对照培养基中的粉拟青霉菌生长快，其中，大部分菌株在以葡萄糖为碳源的培养基中生长最好，与其他碳源处理差异极显著，在以淀粉为碳源的培养基中，各粉拟青霉菌菌丝生长最差，但产孢最丰富;氮源有利于粉拟青霉菌产孢，各粉拟青霉菌对氮源中的甘氨酸、硝酸钾和硫酸铵能够很好地利用，在含有甘氨酸、硝酸钾和硫酸铵的培养基中生长的粉拟青霉菌比对照培养基中生长的粉拟青霉菌的菌落厚且产孢多，其中，在以甘氨酸为氮源的培养基中生长的粉拟青霉菌生长最好，产孢最多。
　　最适生长条件下，各粉拟青霉菌株之间在生长和产孢方面存在一定差异。其中，菌株2-G5在生长和产孢的最适光照条件、氮源以及生长最适碳源等方面与其他菌株之间的差异最明显，而菌株2-E2-2和L-8的最适生长条件相同，差异最不明显。

目录

声明

论文说明

摘要

1 文献综述

1．1 贡嘎蝙蝠蛾拟青霉病研究进展

1．1．1 贡嘎蝙蝠蛾拟青霉病现状

1．1．2 粉拟青霉菌的分类地位

1．1．3 粉拟青霉菌的主要特征和生物学特性

1．1．4 粉拟青霉菌的侵染过程及致病机理

1．1．5 粉拟青霉菌的分子研究进展

1．2 遗传学研究

1．2．1 遗传多样性在植物病原真菌研究中的内容与意义

1．2．2 植物病原真菌研究中常用的遗传多样性分析方法

1．3 ISSR标记技术及应用

1．3．1 ISSR技术在鉴定与检测中的应用

1．3．2 ISSR技术在病原真菌遗传多样性研究中的应用

1．3．3 ISSR在遗传分化研究中的应用

1．4 研究意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试菌株

2．1．2 供试试剂

2．1．3 供试引物

2．1．4 试验仪器

2．2 DNA的提取

2．2．1 菌丝体的培养与收集

2．2．2 DNA的提取方法

2．2．3 DNA浓度与纯度检测

2．3 ITS方法鉴定

2．3．1 ITS-PCR体系及程序

2．3．2 ITS-PCR产物检测及测序

2．3．3 ITS-PCR序列分析

2．4 ISSR方法

2．4．1 ISSR-PCR体系建立及优化

2．4．2 ISSR引物筛选

2．4．3 ISSR-PCR扩增反应及产物检测

2．4．4 数据处理及分析

2．5 生物学特性差异研究

2．5．1 温度对菌株生长及产孢量的影响

2．5．2 pH对菌株生长及产孢量的影响

2．5．3 碳源对菌株生长及产孢量的影响

2．5．4 氮源对菌株生长及产孢量的影响

2．5．5 光照对菌株生长及产孢量的影响

2．5．6 数据分析

3 结果与分析

3．1 DNA的检测

3．2 rDNA-ITS区鉴定

3．2．1 rDNA-ITS区电泳图结果

3．2．2 rDNA-ITS区的扩增及分析

3．3 ISSR标记分析

3．3．1 ISSR-PCR体系建立及优化

3．3．2 引物筛选

3．3．3 ISSR-PCR扩增及分析

3．4 生物学特性差异分析

3．4．1 温度对各菌株生长及产孢量的影响

3．4．2 pH对各菌株生长及产孢量的影响

3．4．3 碳源对各菌株生长及产孢量的影响

3．4．4 氮源对各菌株生长及产孢量的影响

3．4．5 光照对各菌株生长及产孢量的影响

4 结论与讨论

4．1 粉拟青霉菌的遗传多样性研究

4．2 粉拟青霉菌的生物学特性研究

参考文献

致谢

附录