抗幽门螺杆菌特异性卵黄抗体IgY制备和效果评价

摘要

幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是引起胃相关疾病的重要因素，世界卫生组织将其列为Ⅰ类致癌因子。目前“三联”或“四联”疗法是临床治疗H.pylori相关疾病的主要手段，但是耐药菌株的出现导致该方法的治愈率越来越低，因此开发高效、安全、经济且不会产生耐药性的药物显得尤为迫切和重要。
　　卵黄抗体（Specific eggyolk immunoglobulin）IgY，是禽类主要的血清免疫球蛋白，国内外研究表明幽门螺杆菌全菌或某类致病因子的重组蛋白制备的抗H.pylori特异性IgY也可以达到治疗感染H.pylori的效果。
　　H.pylori在胃部低pH(＜2)情况下利用尿素酶水解从血液中扩散出的尿素为氨水和二氧化碳，在菌体周围形成“氨云”中和胃酸。有利于H.pylori穿过胃黏液层，定植于胃上皮细胞表面。H.pylori尿素酶B亚单位是主要的功能单位，包含尿素酶的活性中心。尿素酶膜通道蛋白UreI对幽门螺杆菌在人和动物体内生存起关键作用。
　　本实验在前期对H.pylori的ureI和ureB基因的生物学作用进行研究的基础上，成功的制备了抗SS1全菌的IgY和抗重组尿素酶的IgY，拟通过此体外抑菌实验以及体内动物实验来评价两种IgY抗体的治疗效果，为最终制备治疗性抗幽门螺杆菌特异性抗体制剂提供基础研究材料。本实验的研究方法，结果与结论如下:
　　1.制备SS1-IgY和IB-IgY
　　以超破SS1菌液和IB重组蛋白为抗原免疫蛋鸡;水稀释法和两次硫酸铵沉淀法分离纯化IgY; SDS-PAGE检测纯度，ELISA检测效价，K5600检测浓度。纯化后的两种IgY纯度均超过80％，效价超过1∶12800，浓度可达30mg/ml。
　　2.两种IgY体外抑菌效果评价
　　分别将两种特异性IgY与新鲜H.pylori菌液混合后涂板孵育，对菌落克隆数进行统计分析。SS1-IgY组和IB-IgY组与生理盐水组相比差异显著，说明两种IgY均可在体外抑制Hpylori的生长。
　　3.两种Igy对尿素酶的抑制作用
　　将新鲜H.pylori菌液超声破碎后得到含有大量尿素酶的溶液，将其分别与两种IgY混合孵育后进行快速脲酶检测。结果表明两种抗H.pylori特异性IgY均有抗尿素酶活性，且SS1-IgY的效果更好。
　　4.建立H.pylori感染BALB/c小鼠模型
　　6周龄小鼠，染菌前12h禁食禁水，前10min用0.2M碳酸氢钠灌胃处理，以0.2ml浓度为1×108cfu/ml的SS1菌液灌胃，共3次灌胃，每次间隔1d。4w后根据革兰氏染色镜检、PCR，快速尿酶试验检测结果判定成功建立了H.pylori感染BALB/c小鼠模型。
　　5.两种IgY在动物实验中对H.pylon的抑制作用
　　将6周龄小鼠随机分为7组，分别为IB-IgY3mmg组，6mmg组，SS1-IgY3mmg组，6mmg组，奥美拉唑与克拉霉素联合组，阳性感染组与生理盐水组。与建模时相同的处理方法对实验组小鼠进行细菌灌胃，1w后对小鼠进行治疗。治疗间隔1d，治疗7d，治疗结束后1w进行革兰氏染色镜检，PCR检测以及快速尿酶试验。结果表明在治疗剂量达到6mg/只时，两种IgY的治疗效果与奥美拉唑与克拉霉素联合组大体相当。
　　以上结果表明，在治疗H.pylori感染的应用上,SS1-IgY与IB-IgY均具有体外抑制H.pylori尿素酶活性和抑制H.pylori生长的作用，在体内也能有效抑制H.pylori，两者均具有较大开发潜力。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 综述

1 幽门螺杆菌

2 幽门螺杆菌感染

2．1 流行病学概况

2．2 中国区域幽门螺杆菌感染流行病学状况及趋势

2．3 我国各年龄阶段幽门螺杆菌感染情况

3 幽门螺杆菌的治疗方法

4 卵黄抗体

4．1 卵黄抗体的优势

4．2 不同类型的抗幽门螺杆菌特异性IgY的研究现状

4．3 商品化IgY

第二章 特异性IgY的制备

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 免疫后抗体IgY效价的变化

2．2 抗H．pylori特异性IgY的浓度和纯度

3 讨论

第三章 特异性IgY体外抑菌效果评价

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 IgY体外抑菌涂板

2．2 快速尿酶试验

3．讨论

第四章 特异性IgY动物实验效果评价

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 建立幽门螺杆菌感染BALB／c小鼠模型

2．2 抗幽门螺杆菌特异性IgY对小鼠的治疗

3 讨论

结论

参考文献

附录

致谢