大熊猫肠道病毒生态学调查及部分病毒的遗传进化与大熊猫源CPV的分离鉴定

摘要

大熊猫病毒性传染病作为大熊猫的重要疾病之一，愈来愈受到人们的重视，在病毒性传染病中肠道疾病对大熊猫种群危害较大。由于物种限制，对大熊猫肠道易感病毒性疾病的系统性研究还是空白。本研究选取对大熊猫威胁较大的5种易感肠道病毒，即犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、轮状病毒和犬腺病毒作为研究对象，建立其分子生物学检测方法，并用该方法调查不同地区、不同饲养方式以及不同年份的大熊猫携带肠道病毒的情况;对调查为阳性的部分病毒变异基因进行克隆测序，使用生物信息学软件进行分析，研究其遗传变异趋势;采用细胞培养法，对部分阳性样本进行病毒分离，得到大熊猫源病毒株。本研究主要包括以下几个方面:
　　1.大熊猫易感肠道病毒分子检测方法建立
　　根据GenBank中收录的大熊猫易感的4种肠道病毒保守基因序列，设计4对特异性引物，建立了大熊猫易感肠道病毒的分子生物学检测方法。运用所建立的方法对病毒疫苗株进行扩增，成功扩增出目标条带，特异性试验表明其特异性好，敏感性试验表明其敏感性较高，重复性和稳定性试验表明检测结果准确可靠。研究结果表明，所建立的方法可用于大熊猫易感肠道病毒的临床诊断和实验研究。
　　2.大熊猫肠道病毒的生态学调查
　　应用所建立的4种检测方法和实验室原已建立好的大熊猫源轮状病毒检测方法对收集于2011年至2013年期间来自于岷山、邛崃、相岭山系的野生大熊猫及四川地区圈养大熊猫的188份大熊猫材料，进行分子流行病学调查。共检出CDV阳性8份，CPV阳性19份，CCV阳性1份，CAV阳性2份，RV阳性13份。调查结果显示，野生大熊猫的肠道疾病种类数量及感染率低于圈养大熊猫;2011和2012年期间大熊猫感染肠道病原种类数量低于2013年;大熊猫肠道病原种类及感染率在5个不同地区的差异较大，本实验的研究数据丰富了大熊猫肠道病毒生态学的内容。
　　3.大熊猫源部分肠道病毒的遗传变异分析
　　分别扩增大熊猫源犬瘟热病毒H基因和细小病毒VP2基因，并进行克隆测序，同时从GenBank下载标准株序列，进行序列比对并构建遗传进化树进行分析，确定其基因型。对CDV H基因潜在天冬酰胺糖基化位点进行预测，结果表明大熊猫源犬瘟热病毒糖基化位点出现变异，属于Asia-1基因型;对大熊猫源细小病毒进行遗传变异分析，结果表明在其VP2基因的第370位氨基酸位点发生变异，属于New-CPV-2a基因型。
　　4.大熊猫源部分肠道病毒的分离鉴定
　　对大熊猫细小病毒检测为阳性的样品进行病毒的分离培养及鉴定，结果显示，该病毒可在MDCK细胞上生长并出现明显的细胞病变。并用CPV检测引物进行验证，测序并提交NCBI上进行比对，其与犬细小病毒相应序列相似性均大于98％，证明该病毒为大熊猫源犬细小病毒。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 大熊猫易感肠道病毒性传染病感染情况

1．1 大熊猫犬瘟热病毒(CDV)感染情况

1．2 大熊猫犬细小病毒(CPV)感染情况

1．3 大熊猫犬冠状病毒(CCV)感染情况

1．4 大熊猫犬腺病毒(CAV)感染情况

1．5 大熊猫轮状病毒(RV)感染情况

2 大熊猫疫苗免疫现状及效果

2．1 大熊猫疫苗免疫现状

2．2 大熊猫疫苗免疫效果

3 小结与展望

第二章 大熊猫易感肠道病毒分子检测方法的建立

1 材料与方法

1．1 病毒株

1．2 主要试剂

1．3 引物的设计与合成

1．4 病毒基因组RNA及DNA的提取

1．5 反转录合成cDNA

1．6 PCR反应及优化反应条件

1．7 扩增产物的检测及鉴定

1．8 RT-PCR／PCR特异性试验

1．9 RT-PCR／PCR敏感性试验

1．10 RT-PCR／PCR重复性及稳定性试验

2 结果

2．1 CDV检测方法的建立

2．2 CPV检测方法的建立

2．3 CCV诊断方法的建立

2．4 CAV检测方法的建立

3 分析与讨论

3．1 CDV诊断方法的应用前景

3．2 CPV诊断方法的应用前景

3．3 CCV诊断方法的应用前景

3．4 CAV诊断方法的应用前景

4 小结

第三章 大熊猫肠道病毒生态学调查

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 主要试剂和仪器

1．3 引物

1．4 基因组RNA及DNA的提取

1．5 RT-PCR／PCR检测

2 结果

3 分析与讨论

第四章 大熊猫源肠道病毒的遗传变异分析

一、基于H蛋白基因对大熊猫源犬瘟热病毒遗传变异分析

1 材料与方法

2 结果

3 分析与讨论

二、基于VP2蛋白基因对大熊猫源犬细小病毒遗传变异分析

1 材料与方法

2 结果

3 分析与讨论

第五章 大熊猫源细小病毒的分离鉴定

1 材料与方法

1．1 细胞、菌种及主要试剂

1．2 样品处理

1．3 培养细胞

1．4 增殖病毒

1．5 病毒毒力测定

1．6 病毒对理化因子敏感性试验

1．7 PCR鉴定

1．8 幼犬回归试验

2 结果

2．1 病毒的分离与培养

2．2 病毒毒力及理化测定结果

2．3 PCR鉴定结果

2．4 动物回归试验结果

3 分析与讨论

结论与创新

参考文献

致谢

作者简介及攻读硕士期间发表论文情况