脂联素(AdipoQ)及其受体(AdipoR1/2)对山羊脂肪沉积的作用机制研究

摘要

本试验目的是研究AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2对山羊脂肪沉积的作用机制，为后续通过AdipoQ来调控山羊肌肉中的脂肪酸合成，改善山羊肉品质提供依据。试验克隆得到南江黄羊AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2基因的全长编码区序列。利用半定量RT-PCR检测3个基因在山羊11个组织（皮下脂肪、背最长肌、股二头肌、腓肠肌、卵巢、子宫、脑、瘤胃、肾脏、肝脏和心脏）中的表达模式。利用qPCR检测AdipoQ、Adipo R1和AdipoR2基因在南江黄羊出生后5个发育阶段(3d、30d、60 d、90 d和120 d)背最长肌中mRNA的相对表达量。利用含高浓度葡萄糖的培养基(25 mM/L)诱导山羊骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cells，SMSCs)向脂肪细胞分化，油红O染色检测细胞内脂肪滴的沉积，qPCR检测AdipoQ、AdipoR1、AdipoR2、脂肪酸合成及成脂分化相关基因的相对表达量。构建AdipoQ基因过表达载体pEGFP-N1-AD，并在山羊SMSCs中过表达AdipoQ基因。荧光显微镜检测融合蛋白的亚细胞定位，qPCR检测AdipoR1、AdipoR2、脂肪酸合成及成脂分化相关基因的相对表达量。结果如下:
　　(1)克隆得到南江黄羊AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2基因的CDS区全序列（GenBank登录号分别为JX573539、KC286912和JX573540）。CDS区全长分别为720 bp、1128 bp和1176 bp，编码氨基酸数分别为239、375和391。南江黄羊与人、牛和猪AdipoQ基因核苷酸序列的一致性达到85％、97％和88％;AdipoR1基因核苷酸序列一致性为87％、97％和90％; AdipoR2基因核苷酸序列一致性为86％、97％和88％，表明3个基因在物种间高度保守。
　　(2)半定量RT-PCR检测到AdipoQ基因mRNA在脂肪组织中表达量最高，在肌肉组织和肝脏中表达量相对较低，其它组织中无表达。AdipoR1基因mRNA在所有组织中都有表达，在肌肉组织、瘤胃、脂肪组织中表达量较高，其它组织中表达量较低。AdipoR2基因mRNA同样在所有组织中都有表达，在脂肪组织、肌肉组织中表达量相对较高，在其它组织中表达量较低。3个基因主要在脂肪组织和肌肉组织中表达，表明3个基因在这些组织中起到重要作用。
　　(3)利用qPCR检测南江黄羊背最长肌(3d、30d、60 d、90 d和120 d) AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2基因mRNA的相对表达量，发现在南江黄羊公、母羊背最长肌中AdipoQ的表达相似，呈上升-下降-上升趋势，公羊中3d时表达量最低(P＜0.05)，120 d时表达量最高(P＜0.05);母羊中3d时表达量最低(P＜0.05)，60 d时表达量最高(P＜0.05)。AdipoR1在南江黄羊公羊背最长肌中表达趋势为下降-上升，在60 d时表达量最高(P＜0.05)，90 d时表达量最低(P＜0.05);母羊中表达趋势为下降-上升-下降，在30 d时表达量最低(P＜0.05)，60 d时表达量最高(P＜0.05)。AdipoR2在南江黄羊公、母羊背最长肌中表达趋势分别为下降-上升和下降-上升-下降，都是在30d时表达量最低(P＜0.05)，90 d时表达量最高(P＜0.05)。
　　(4)山羊SMSCs在高糖培养基诱导下合成脂肪酸，油红O染色发现培养6d后开始出现少量脂肪滴沉积，培养至10d时细胞内沉积大量脂肪滴，而低糖组无明显脂肪滴沉积。同时qPCR检测到脂肪酸合成及成脂分化相关基因ACC、FAS、C/EBPα、PPARγ和SREBP-1表达量均显著性升高，表明高糖能上调SMSCs中上述基因的表达，促进脂肪酸合成及向类脂肪细胞转化。在成脂分化过程中AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2表达量也有显著上升，表明AdipoQ及其受体基因可能参与了脂肪酸合成及成脂分化的调控。
　　(5)在山羊SMSCs中过表达AdipoQ基因，发现AdipoQ融合蛋白只在细胞质中表达，表明AdipoQ主要在细胞质中发挥作用。另外qPCR检测发现试验组中ACC、FAS、SREBP-1、AdipoR2基因表达量显著升高，而AdipoR1、C/EBPα、PPARγ基因表达量无明显变化，表明AdipoQ能上调ACC、FAS、SREBP-1和AdipoR2基因，促进脂肪酸的合成。

目录

论文说明

声明

摘要

英文符号说明

1 文献综述

1．1 AdipoQ及AdipoR1／2的研究进展

1．1．1 AdipoQ的结构与分布

1．1．2 AdipoR1／2的结构与分布

1．1．3 AdipoQ及AdipoR1／2的生物学功能

1．1．4 AdipoQ及AdipoR1／2的调控

1．2 SMSCs简介

1．3 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验组织样品

2．1．2 山羊SMSCs

2．2 仪器与试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．3 试验方法

2．3．1 总RNA的提取

2．3．2 总RNA的质量检测

2．3．3 cDNA的合成

2．3．4 AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2基因的克隆

2．3．5 AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2基因的表达分析

2．3．6 山羊SMSCs的成脂分化

2．3．7 AdipoQ基因在山羊SMSCs中的过表达

2．4 统计分析

3 试验结果与分析

3．1 AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2的克隆及序列分析

3．1．1 RNA质量的检测

3．1．2 目的基因的克隆结果

3．1．3 测序及生物信息学分析结果

3．1．4 AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2蛋白结构

3．2 AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2的组织表达

3．3 AdipoQ、AdipoR1和AdipoR2在背最长肌中的表达

3．4 山羊SMSCs的诱导分化

3．4．1 细胞中的脂肪滴沉积

3．4．2 脂肪酸合成及成脂分化相关基因的表达

3．4．3 分化过程中基因表达的相关性

3．5 AdipoQ基因的过表达

3．5．1 AdipoQ的载体构建

3．5．2 AdipoQ的亚细胞定位

3．5．3 AdipoQ对相关基因的调控

4 讨论

4．1 基因的克隆及生物信息学分析

4．2 基因的组织表达规律

4．3 基因在背最长肌中的表达

4．4 山羊SMSCs的成脂分化

4．5 AdipoQ在SMSCs中的过表达

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录