鸭瘟病毒US2蛋白特性分析及小RNA干扰对US2基因功能影响初探

摘要

关于鸭瘟病毒(Duck Plague Virus，DPV) US2基因的研究很少，本论文将本实验注册的DPV-CHv株US2基因(GenBank Accession:EU195086)进行了生物信息学分析，开展原核表达、US2蛋白纯化、兔抗蛋白抗体的制备等，然后分别通过实时荧光定量PCR和Western Blot来检测US2基因在DPV感染鸭胚成纤维细胞过程中转录水平的变化以及表达动力学过程。为了更清晰地揭示US2蛋白在细胞中的动态过程，我们采用了间接荧光免疫方法来检测US2的定位，同时通过病毒蛋白酶K实验鉴定了US2蛋白属性。为了验证US2基因是否有抗原递呈功能，用小RNA干扰载体来干扰US2基因的功能，然后用MHC ELISA试剂盒来检测US2基因干扰前后的MHC水平的变化。
　　1.鸭瘟病毒US2基因的克隆、原核表达以及多抗的制备对鸭瘟病毒US2基因进行序列分析、克隆及原核表达，并利用获得的His重组蛋白分别制备了兔抗US2-IgG多克隆抗体，抗体琼扩效价为1∶16。
　　2.鸭瘟病毒感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后US2基因mRNA转录水平、表达动力学及细胞定位分析采用实时荧光定量PCR技术对DPV感染DEF不同时期US2 mRNA的水平变化进行荧光定量分析;并提取不同感染时期细胞蛋白，利用蛋白免疫印迹法检测US2蛋白在DEF中的表达水平变化。荧光定量结果表明:DPV感染DEF24h至72h，US2基因转录水平持续上升，84h至96h US2 mRNA含量急剧下降，与对照组的转录水平相比，有明显差异。免疫印迹结果表明，DEF感染DPV从48h开始能明显检测到US2蛋白。间接荧光免疫实验显示DEF感染DPV从39h-50h，蛋白主要集中在细胞膜上，而且越来越多;从60h开始集中在细胞质和细胞核周围，到了84h时，蛋白在细胞质中明显增多。
　　3.利用小RNA干扰US2基因的表达，检测到被DPV感染的DEF细胞表面MHC的表达量有所减少针对US2ORF的不同靶区，我们设计并合成4个shRNA载体以确保靶基因被有效抑制。目的是筛选出有效的干扰shRNA来干扰DPV US2基因转录，为研究DPV US2基因的功能提供基础。用荧光定量技术筛选出能有效干扰US2基因转录的RNA载体，然后干扰US2转录表达，用MHC ELISA试剂盒检测到DEF细胞表面上的MHC的表达量有显著增加，该实验可以推断DPV US2基因对DEF细胞表面的MHC抗原递呈分子的表达有抑制作用。
　　4.用浓缩纯化的病毒颗粒进行病毒蛋白酶K实验证实了US2蛋白是皮层蛋白研究鸭瘟病毒US2基因表达产物是否属于结构蛋白，属于哪种结构蛋白，对探索其基因编码蛋白的功能、病毒的转染、出芽、释放等具有重要的意义。目前文献中提到US2蛋白在疱疹病毒中属于外膜或者皮层蛋白，但是对DPV的US2蛋白是哪种蛋白并没有作探究。该实验利用高浓度蔗糖溶液来浓缩病毒粒子，然后分别用去垢剂SDS和蛋白酶K分别来溶解DPV的外膜脂溶性蛋白和其他蛋白成分，同时用已经明确是皮层蛋白的UL51蛋白作为对照，实验结果证明了US2蛋白在DPV中是一种皮层蛋白。

目录

声明

摘要

一、引言

1 鸭瘟概述

1．1 鸭瘟

1．2 病原

1．3 流行病学

1．4 防控措施

2 疱疹病毒US2基因及其编码蛋白的研究进展

2．1 疱疹病毒基因组的特点

2．2 US2基因的特点

2．3 US2基因编码蛋白US2的特点

2．4 疱疹病毒US2蛋白的功能

3 US2编码蛋白与其他蛋白的相互作用

3．1 US2编码蛋白与US10蛋白的相互作用

3．2 US2编码蛋白和US11蛋白的作用

4 展望

5 选题目的和意义

二、试验研究

1 材料

1．1 动物及毒株、菌种、载体

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

2 方法

2．1 DPV US2生物信息学分析

2．2 DPV US2基因原核表达及多克隆抗体制备

2．3 DPV US2基因转录水平和基因类型分析

2．4 DPV US2基因表达动力学、蛋白属性和细胞定位研究

2．5 小RNA干扰对DPV US2基因功能影响探究

3 结果

3．1 DPV US2生物信息学分析

3．2 DPV US2基因原核表达及多克隆抗体制备

3．3 DPV US2基因转录水平和基因类型分析

3．4 DPV US2基因表达动力学、蛋白属性和细胞定位研究

3．5 小RNA干扰对DPV US2基因功能影响探究

4 讨论

4．1 DPV US2生物信息学分析

4．2 DPV US2基因原核表达及多克隆抗体制备

4．3 DPV US2基因转录水平和基因类型分析

4．4 DPV US2基因表达动力学、蛋白属性和细胞定位研究

4．5 小RNA干扰对DPV US2基因功能影响探究

三、结论

参考文献

致谢

作者简介及攻读硕士学位期间发表的学术论文