天府肉羊MYOZ2和MYOZ3基因的克隆及其在肌肉组织和部分器官中的表达分析

摘要

肉质是畜禽生产的重要经济性状，其中一个重要的影响因素就是肌纤维。肌纤维类型与肉质的关系十分密切，其中慢肌纤维比例高的肌肉肉质更好，它是在很多基因控制下的产物。钙调磷酸酶（calcineurin，CaN）是一种常见的细胞信号分子，它参与的CaN/NFAT信号通路可以影响肌纤维类型，尤其是对促进慢肌纤维的转变有重要的作用。研究发现钙调磷酸酶肌小节结合蛋白基因家族（MYOZs）可以通过改calcineurin的活性来影响肌纤维类型的转变，从而影响畜禽的肉质。为了探究天府肉羊MYOZ2基因和MYOZ3基因在肌纤维转化方面的作用，本试验利用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、分子克隆、实时荧光定量(RT-qPCR)以及蛋白免疫印迹法(western blotting)等实验技术对MYOZ2基因和MYOZ3基因进行了初步的研究，结果如下:
　　1.本研究成功获得天府肉羊MYOZ2基因和MYOZ3基因的cDNA全部编码序列，MYOZ2基因序列长856bp，包含一个长度为795bp的ORF框，编码264个氨基酸;MYOZ3基因序列长为832bp，含有一个大小为735bp的ORF框，编码244个氨基酸。将其提交至NCBI，获得两个基因的登录，分别是JX573191和KC537058。
　　2.核酸序列和氨基酸序列比对发现MYOZ2基因较MYOZ3基因更加保守;系统进化分析发现，MYOZ2和MYOZ3与绵羊的亲缘关系最近，与爪蟾的亲缘关系最远。
　　3.蛋白性质和结构分析发现MYOZ2蛋白和MYOZ3蛋白都含有若干个磷酸化位点，都是亲水蛋白，不含跨膜结构、信号肽序列以及糖基化位点，而且它们具有相同的Calsarcin保守结构域，二级结构上都包含α-螺旋、无规卷曲及延伸片断三种形式，且以前两者为主。
　　4.利用实时荧光定量PCR技术检测了MYOZ2基因和MYOZ3基因在300日龄8个不同组织中的相对表达量。结果显示MYOZ2基因在天府肉羊的腹直肌和心肌中有较高水平的表达，股二头肌和背最长肌的表达量较低，而肝脏、脾脏、肺和肾脏的表达量极其微少;MYOZ3基因在腹直肌中表达量最高，股二头肌、肾脏、肺、背最长肌和脾脏中的表达量也较高，心肌和肝脏中几乎没有表达。在不同的日龄的4种不同肌肉组织中，MYOZ2基因和MYOZ3基因的表达量变化波动各不相同。
　　5.使用蛋白免疫印迹方法检测天府肉羊MYOZ2蛋白和MYOZ3蛋白在300日龄8个不同组织中的表达情况。结果显示:MYOZ2蛋白和MYOZ3蛋白只在心肌、股二头肌、腹直肌和背最长肌中检测到表达，而内脏组织中没有检测到表达，并且它们在股二头肌中表达量明显高于其他组织，但是MYOZ2蛋白在背最长肌中表达最低，而MYOZ3蛋白则是在心肌中表达最低;不同生长阶段的背最长肌和比目鱼肌中都检测到MYOZ2蛋白和MYOZ3蛋白的表达，但是表达的变化趋势各不相同。

目录

论文说明

声明

摘要

常用词语缩写

1 文献综述

1．1 肌纤维的类型

1．2 肌纤维的特点

1．3 Ⅰ型肌纤维对肌肉品质的影响

1．3．1 肉色

1．3．2 pH值

1．3．3 嫩度

1．3．4 风味

1．3．5 系水力

1．4 钙调磷酸酶在肌纤维分化上的作用

1．5 钙调磷酸酶肌小节结合蛋白家族的研究现状

1．6 本研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物及样品采集

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂及试剂盒

2．1．4 主要试剂的配制

2．2 试验方法

2．2．1 组织样总RNA的抽取

2．2．2 总RNA的质量与浓度检测

2．2．3 cDNA第一条链的合成

2．2．4 特异性引物设计

2．2．5 MYOZ2和MYOZ3基因的cDNA的克隆测序

2．2．6 荧光定量PCR

2．2．7 蛋白免疫印迹

2．3 数据分析

3 结果与分析

3．1 天府肉羊MYOZ2和MYOZ3基因的克隆

3．1．1 组织样的总RNA提取

3．1．2 PCR结果

3．1．3 克隆产物测序结果

3．2 天府肉羊MYOZ2和MYOZ3基因生物信息学分析

3．2．1 天府肉羊MYOZ2基因的生物信息学分析

3．2．2 天府肉羊MYOZ3基因的生物信息学分析

3．3 mRNA的表达

3．3．1 标准曲线的绘制

3．3．2 天府肉羊MYOZ2和MYOZ3基因的mRNA表达

3．4 蛋白质的表达

3．4．1 天府肉羊MYOZ2蛋白的表达

3．4．2 天府肉羊MYOZ3的蛋白表达

4 讨论

4．1 MYOZ2基因和MYOZ3基因的生物信息学分析

4．1．1 MYOZ2基因和MYOZ3岁基因的序列分析

4．1．2 MYOZ2蛋白和MYOZ3蛋白的理化性质分析

4．1．3 MYOZ2蛋白和MYOZ3蛋白结构的预测分析

4．2 mRNA的表达分析

4．2．1 不同组织表达分析

4．2．2 不同生长阶段表达分析

4．3 蛋白质的表达分析

4．3．1 不同组织表达分析

4．3．2 不同生长阶段表达分析

5 结论

参考文献

致谢

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