动物性食品源大肠杆菌对抗生素与消毒剂耐药性及PFGE分型研究

摘要

大肠杆菌(Escherichia coli)是国际公认的食品卫生和耐药性监测重要的指示菌，可以通过食物链传播，并感染人和动物，导致腹泻，感染致病性较强的血清型时还能致命。抗生素是预防和治疗大肠杆菌等病原菌感染的重要手段，近年来由于抗生素的广泛及不合理使用，食源性大肠杆菌对抗生素耐药性增强。为了降低传染的发生、阻止抗生素耐药菌的进一步危害，环境消毒控制成为控制病原菌传播的主要措施，目前，季铵盐类(Quaternary Ammonium Compounds，QACs)消毒剂已被广泛用于养殖、食品加工等环境的消毒，然而消毒剂使用的增多是否会导致细菌对消毒剂的耐药也成为众多学者关心的问题，已有报道发现抗生素可以与季铵盐类消毒剂共同耐药，但目前国内关于动物性食品源大肠杆菌对消毒剂耐药及与抗生素共同耐药的研究报道较少。
　　本研究从四川省部分市县采集肉类样品，分离大肠杆菌，并利用形态学、生理生化及16S rDNA鉴定。按照CLSI推荐方法及判断标准，应用药敏纸片法测定大肠杆菌对11种不同抗生素的敏感性，应用琼脂稀释法测定大肠杆菌对季铵盐类消毒剂(QACs)的MIC值，并应用PCR方法检测QACs耐药基因和1型整合子，分析大肠杆菌对消毒剂耐药性与抗生素耐药表型之间的关系，对含有可移动遗传元件介导的QACs耐药基因的菌株PFGE分型，并选择部分菌株进行接合试验。本研究主要开展了三个方面的研究:
　　1动物性食品源大肠杆菌的分离及对抗生素的耐药性
　　2009-2013年从四川省不同地区采集肉类样品328份包括:猪肉203份，牛肉66份，鸡肉59份，分离培养基分离，16S rDNA鉴定出大肠杆菌255株(77.74％):鸡肉50株(84.75％)，猪肉161株(79.31％)，牛肉44株(66.67％)。采用纸片扩散法对11种常用药敏纸片进行药敏试验，结果显示:218株(85.49％)大肠杆菌对11种抗生素表现出不同程度的耐药性，特别是氨苄西林，磺胺甲恶唑，四环素。多重耐药分析结果显示，255株动物性食品源大肠杆菌中，126株(49.41％)大肠杆菌为多重耐药菌株，各种耐药谱型中，3重耐药菌株所占比例最大为13.73％(n=35)，其次为5重耐药为13.33％(n=34)，优势耐药谱型分别为S3(n=21); S3-TET(n=18); TET(n=16);AMP-S3-TET(n=13)。
　　2动物性食品源性大肠杆菌对QACs消毒剂的耐药性
　　琼脂稀释法测定255株大肠杆菌对三种季铵盐消毒剂的MIC值，PCR扩增10种季铵盐类消毒剂耐药基因，检测255株大肠杆菌的1型整合子的流行情况，分析其与大肠杆菌多重耐药的关系，选取部分可移动遗传元件介导的消毒剂耐药基因阳性菌株开展接合试验。结果表明各消毒剂MIC范围是:CPC，8-512 mg/L; CTAB，16-512mg/L; BC，16-1024mg/L; DDAC4-1024 mg/L。QACs耐药基因检出率为:ydgE(87％;221/255),mdfA(85％;218/255),sugE(c)(83％;212/255),ydgF(80％;203/255),emrE(78％;200/255),qacE△1(20％;50/255),qacF(18％;46/255),sugE(p)(7％;7/255),未检出qacE、qacG。供试大肠杆菌1型整合子检出率较低，255株大肠杆菌仅66株检出(25.88％)。接合试验证实qacF,qacE△1，sugE(P)的传播性。所有抗生素耐药菌中qacF检出率显著高于抗生素敏感菌(p＜0.05)，猪肉源中大肠杆菌中qacE△1基因与抗生素耐药显著相关(p＜0.05）。
　　3质粒介导的消毒剂耐药基因阳性菌株的PFGE分型
　　对含有sugE(p)、qacE△1或qacF的96株大肠杆菌进行PFGE分型。结果表明96株大肠杆菌可以分为13个型73个亚型，耐药大肠杆菌来源与肉类采集地点（不同超市）相关，部分同源性较高的菌株中，抗生素耐药谱型相似。部分菌株消毒剂耐药基因与PFGE谱型相关，A、B型大肠杆菌中主要基因组合为emrE-mdfA-sugE(c)-ydgE-ydgF-qacF，C型中mdfA-sugE(c)-ydgE-ydgF-qacE△1基因组合流行率较高。
　　本研究发现动物性食品源大肠杆菌污染情况较严重，菌株对抗生素的耐药率及多重耐药率相对较低，大肠杆菌对季铵盐类消毒剂具有较高MIC值，消毒剂耐药基因检出率高，消毒剂耐药基因qacE△1、qacF与抗生素耐药具有相关性。耐药大肠杆菌来源与肉类采集地点相关，应加强对动物性食品源大肠杆菌污染及耐药性监测，并需注重肉类零售环节的耐药性传播与防控。

目录

声明

摘要

缩写词及中英文对照

前言

1 动物性食品源大肠杆菌污染状况

2 大肠杆菌对抗生素的耐药性

2．1 耐药机制

2．2 耐药表型

2．3 耐药基因型

3 大肠杆菌对消毒剂的耐药性

3．1 季铵盐类消毒剂简介

3．2 耐药机制

3．3 耐药表型

3．4 耐药基因型

4 整合子与耐药性的关系

4．1 与抗生素耐药性的关系

4．2 与消毒剂耐药性的关系

5 抗生素与消毒剂耐药性的关系

5．1 抗生素与消毒剂耐药表型之间的联系

5．2 抗生素与消毒剂耐药基因型之间的联系

6 食源性细菌的PFGE分型

7 本研究意义

第一章 动物性食品源大肠杆菌分离、鉴定及对抗生素的耐药性

1 材料

1．1 培养基及试剂

1．2 药敏纸片

1．3 样品来源

1．4 实验仪器

1．5 质控菌株

1．6 引物

2 方法

2．1 样品采集

2．2 大肠杆菌分离与鉴定

2．3 药敏试验

3 结果

3．1 动物性食品源大肠杆菌分离率

3．2 动物性食品源大肠杆菌抗生素耐药性

3．3 不同动物源性食品大肠杆菌耐药性的比较

4 讨论

4．1 动物性食品源大肠杆菌污染情况

4．2 动物性食品源大肠杆菌抗生素耐药性

第二章 动物性食品源大肠杆菌对消毒剂耐药性

1 材料

1．1 菌株

1．2 培养基及试剂

1．3 消毒剂

1．4 质控菌株

1．5 仪器

1．6 引物

2 方法

2．1 消毒剂MIC的测定

2．2 消毒剂耐药基因型的检测

2．3 1型整合子基因的检测

2．4 接合试验

3 结果

3．1 动物性食品源大肠杆菌对消毒剂的MIC

3．2 动物性食品源大肠杆菌消毒剂耐药基因流行情况

3．3 动物性食品源大肠杆菌中1型整合子基因检出情况

3．4 接合试验

3．5 大肠杆菌消毒剂耐药与抗生素的关系

4 讨论

4．1 动物食品源大肠杆菌消毒剂MIC

4．2 动物食品源大肠杆菌消毒剂耐药基因流行情况

4．3 消毒剂耐药表型及基因型的关系

4．4 消毒剂耐药性与抗生素耐药性的关系

4．5 整合子与质粒型消毒剂耐药基因的关系

第三章 质粒介导的消毒剂耐药基因阳性菌株的PFGE分型

1 材料

1．1 菌株

1．2 培养基及试剂

1．3 仪器

2 方法

2．1 胶块制作

2．2 裂解细胞

2．3 胶块清洗

2．4 DNA酶切

2．5 制胶及加样

2．6 电泳、染色、成像

2．7 数据分析

3 结果

3．1 PFGE与菌株来源的关系

3．2 PFGE与抗菌药物耐药性

4 讨论

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文及获奖情况