川硬皮肿腿蜂毒液对寄主黄粉虫蛹的影响及其分离纯化

摘要

川硬皮肿腿蜂(Sclerodermus sichuanensis Xiao)隶属于膜翅目(Hymenoptera)肿腿蜂科(Bethylidae)，是松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）和杉棕天牛(Callidium villosulum Fairmaire)等钻蛀性害虫的抑性外寄生蜂。川硬皮肿腿蜂雌蜂生殖系统较简单，毒囊体积所占比例大，无明显萼区，毒液在川硬皮肿腿蜂和寄主昆虫相互关系中起重要作用。为揭示川硬皮肿腿蜂寄生对寄主黄粉虫(Tenebrio molitorL.)蛹的调控机制及麻痹机制，本文通过自然寄生、毒液注射、Sephadex G75层析和PCR等方法研究了寄生过程中毒液的作用，并对毒液中一种麻痹蛋白进行分离纯化，对两种毒液蛋白克隆进行了初步探索。主要结果如下:
　　1.川硬皮肿腿蜂麻痹寄主黄粉虫蛹花费的时间约为0.5～3 h;在一定范围内，寄主蛹被接种成年雌蜂比例越大，被蛰刺的次数与被自然注射毒液量越大，麻痹程度越明显（正相关）;人工注射川硬皮肿腿蜂毒液的寄主蛹会被毒液麻痹;在一定范围内，人工注射寄生蜂毒液量越大，寄主蛹被麻痹的程度越明显（正相关），恢复活动程度越不明显（负相关）。
　　2.川硬皮肿腿蜂毒液具有抑菌、延缓黑化和麻痹三种作用。其中，麻痹作用的活性物质是蛋白质;毒液对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)都有抑制生长作用，且对金黄葡萄球菌的抑制作用高于大肠杆菌。
　　3.温度对川硬皮肿腿蜂毒液的麻痹活性和抑菌性都有影响。40℃以后，随着温度升高，寄生蜂毒液麻痹活性降低，直至60℃麻痹活性完全消失;对大肠杆菌的抑制作用在40℃后升高，50℃以后没有变化;对金黄葡萄球菌的抑制作用在60℃时降低，之后随着温度升高抑制作用消失。
　　4.川硬皮肿腿蜂毒液中存在vpr1～6(venom protein1～6)6种大分子毒液蛋白，这6种大分子蛋白经β-巯基乙醇分解二硫键后可以形成vprⅠ～Ⅸ(venom proteinⅠ～Ⅸ)9条大分子肽链;所有肽链相对分子量均分布于6.5～200 KDa之间，分别为vprⅠ187.83 KDa,vprⅡ88.73 KDa,vprⅢ68.33 KDa,vprⅣ59.40 KDa,vprⅤ38.23KDa,vprⅥ27.30 KDa,vprⅦ16.89 KDa,vprⅧ14.13 KDa,vprⅨ12.94 KDa。
　　5.川硬皮肿腿蜂毒液中的毒液大分子蛋白vpr4具有麻痹活性，且毒液大分子蛋白vpr4能被β-巯基乙醇分解成了两条肽链(vprⅤ，vprⅨ)，即vpr4相对分子质量为vprⅤ和vprⅨ的相对分子质量之和，约为51.17 KDa。
　　6.毒液大分子蛋白vpr4麻痹作用不均衡，其轻微麻痹活性极显著高于0.03 VRE的毒液，但与0.05 VRE的毒液差异不显著;完全麻痹活性极显著高于0.03 VRE，极显著低于0.05 VRE;恢复活动活性极显著低于0.03 VRE，极显著高于0.05 VRE。
　　7.川硬皮肿腿蜂鲜活样品总DNA不易降解，易于提取;麻痹蛋白核心片段克隆最佳退火温度为54℃，丝氨酸蛋白酶核心片段的最佳退火温度为52℃。

目录

声明

摘要

前言

1 文献综述

1．1 寄生蜂蜂毒器官

1．1．1 蜂毒器官外部形态

1．1．2 蜂毒器官超微结构

1．1．3 蜂毒器官附属因子及分泌物

1．1．4 川硬皮肿腿蜂蜂毒器官

1．2 寄生蜂毒液对寄主的调控

1．2．1 毒液对体液免疫的调控

1．2．2 毒液对生长发育的调控

1．2．3 毒液对细胞免疫的调控

1．2．4 毒液对激素的调控

1．2．5 毒液对营养代谢的调控

1．3 寄生蜂部分毒液的克隆分析

1．3．1 利用毒腺cDNA文库

1．3．2 利用毒液蛋白测序

1．3．3 利用毒液蛋白同源性

1．3．4 利用EST分析

2 川硬皮肿腿蜂毒液对替代寄主黄粉虫蛹的影响

2．1 试验材料

2．1．1 试验昆虫与菌株

2．1．2 试验材料前处理

2．1．3 试剂配制

2．2 试验方法

2．2．1 单个毒囊总蛋白含量测定

2．2．2 肿腿蜂自然蛰刺效果

2．2．3 肿腿蜂毒液注射效果

2．2．4 肿腿蜂麻痹成分检测

2．2．5 毒液和菌液及混合液注射效果

2．2．6 平板抑菌试验

2．2．7 温度对毒液麻痹及抑菌作用的影响

2．2．8 数据统计与分析

2．3 结果与分析

2．3．1 毒囊总蛋白含量

2．3．2 自然蛰刺麻痹效果

2．3．3 毒液注射麻痹效果

2．3．4 麻痹成分检测

2．3．5 毒液和菌液及混合液注射效果

2．3．6 毒液的抑菌活性

2．3．7 温度对毒液麻痹及抑菌作用的影响

2．4 小结与讨论

2．4．1 毒液的麻痹与抑制蜕皮作用

2．4．2 毒液的抑菌与延缓黑化作用

3 川硬皮肿腿蜂毒液蛋白的分离纯化

3．1 试验材料

3．1．1 试验昆虫和凝胶

3．1．2 试验材料前处理

3．1．3 试剂配制

3．2 试验方法

3．2．1 毒液样品制备

3．2．2 毒液总蛋白PAGE和SDS-PAGE

3．2．3 麻痹毒液蛋白分离纯化

3．2．4 麻痹蛋白纯度检测

3．2．5 麻痹蛋白活性检测

3．2．6 数据统计与分析

3．3 结果与分析

3．3．1 毒液总蛋白PAGE及SDS-PAGE

3．3．2 麻痹毒液蛋白分离纯化

3．3．3 麻痹毒液蛋白SDS-PAGE纯度检测

3．3．4 麻痹毒液蛋白活性检测

3．4 小结与讨论

4 川硬皮肿腿蜂毒液蛋白相关基因克隆初探

4．1 试验材料

4．1．1 试验材料与试剂

4．1．2 试验材料前处理

4．2 试验方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 总DNA提取

4．2．3 总DNA完整度及纯度检测

4．2．4 核心片段克隆

4．2．5 电泳检测及测序

4．3 结果分析

4．3．1 总DNA提取

4．3．2 核心片段克隆

4．4 小结与讨论

5 全文总结

5．1 主要结论

5．2 本文创新点

5．3 有待研究问题

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表学术论文目录