猪不同生长阶段不同组织线粒体DNA(mtDNA)拷贝数变化

摘要

线粒体DNA(mitochondrial DNA)是动物细胞中核外唯一遗传物质，其拷贝数是衡量细胞中线粒体数目的重要标志。根据组织细胞的能量需求及耗氧量，在哺乳动物体细胞中数目为～1，000-10，000不等拷贝数。在生长发育过程中，组织中mtDNA拷贝数也有不同的变化趋势，以满足组织的能量代谢需求。mtDNA编码37个基因，包括2个rRNA，13个蛋白和22个tRNA。线粒体是半自主细胞器，因为构成线粒体的其他蛋白以及参与mtDNA复制和转录的相关酶类及分子均是由核基因组编码，因此线粒体的遗传体系是依赖核基因组，其中TWINKLE是线粒体中唯一的DNA解旋酶，参与mtDNA复制与转录过程。此外，大量研究发现在哺乳动物中，伴随着生长发育过程，mtDNA会出现长片段缺失变异，导致细胞组织功能异常。研究显示，线粒体中存在转录前调控，发现线粒体DNA序列中存在多个CpG位点及甲基转移酶，推测线粒体基因转录受到了甲基化的调控。
　　对所有试验样品mtDNA是否存在片段缺失进行检测，本试验设计了5对引物对mtDNA全序列进行long PCR扩增，片段长度为1.5kb～5.5kb，凝胶电泳后，未在样品中发现mtDNA出现片段缺失。随后试验选取三个线粒体基因及核单拷贝基因GCG，利用Q-PCR技术定量分析猪从胚胎90日龄到成年中5个年龄点，15个组织（共58个样品）mtDNA的拷贝数变化，以期了解mtDNA拷贝数在组织间的差异及生长过程中各组织mtDNA拷贝数的变化趋势。Q-PCR扩增结果显示5个年龄点里，组织间mtDNA拷贝数均存在显著差异(P＜0.01)。随着生长过程，心肌，背最长肌，腰大肌，肾脏，脑，卵巢和皮下脂肪组织中mtDNA的数目逐渐增加，以满足各组织器官的能量需求。通过定量所有样品中核基因编码mtDNA解旋酶TWINKLE的表达量，结果显示mtDNA拷贝数变化与其变化趋势呈显著正相关(r=0.33，P=0.011)。同时定量分析8个线粒体基因的表达量，扩增结果显示线粒体基因表达水平与mtDNA拷贝数存在线性关系，其中4个基因表达量变化与mtDNA拷贝数变化极显著相关，3个显著相关，1个不显著相关。通过重亚硫酸盐处理样品DNA后进行BSP试验，测序结果中发现mtDNA存在甲基化CpG位点，由此可知猪线粒体DNA的转录受到甲基化调控。
　　实验结果为组织生长发育过程，特别是肌肉生长和脂肪沉积研究，提供了基础数据。

目录

论文说明

声明

摘要

符号说明

1．文献综述

1．1 线粒体(mitochondrion)

1．2 线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)

1．3 mtDNA的复制与转录

1．4 mtDNA拷贝数(mtDNA copy number)

1．5 mtDNA甲基化

1．6 Long PCR

1．7 实时荧光定量PCR(Q-PCR)

2．研究目的及意义

3．材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 试验动物

3．1．2 样品采集

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 实验所需试剂(盒)

3．1．5 常用试剂的配制

3．2 试验方法

3．2．1 DNA提取及检测

3．2．2 总RNA提取及检测

3．2．3 PCR引物设计及合成

3．2．4 Long PCR

3．2．5 定量各样品中mtDNA拷贝数

3．2．6 mRNA反转录

3．2．7 定量各样品中线粒体基因及核基因相关基因表达

3．2．8 mtDNA甲基化检测

3．2．9 数据分析

4．试验结果

4．1 各扩增片段扩增效果无差异

4．2 样品mtDNA不存在大片段缺失

4．3 组织中mtDNA拷贝数存在差异

4．4 TWINKLE基因表达量与mtDNA拷贝数有显著线性关系

4．5 线粒体基因表达量与mtDNA拷贝数存在显著线性关系

4．6 mtDNA D-loop区域存在甲基化

5．讨论

5．1 mtDNA扩增片段选择分析

5．2 mtDNA拷贝数的时空差异性分析

5．3 核基因及线粒体基因与mtDNA拷贝数关联性分析

5．4 mtDNA D-loop区域甲基化分析

6．结论

参考文献

致谢

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