猪源附红细胞体分离鉴定PCR方法的建立及小附红细胞体人工感染试验

摘要

感染猪的附红细胞体分为附红细胞体和小附红细胞体两大类。而国内还未见有关小附红细胞体分离和动物感染试验的报道。通过小附红细胞体病原的分离鉴定及动物感染试验，有助于了解小附红细胞体的生物学特性及致病性。
　　本试验从上海地区2个屠宰场，采集猪抗凝血736份，提取血液基因组DNA作为模板，设计合成两对特异性引物并验证了具有高度敏感性和良好特异性，用两对特异性的引物进行16s RNA基因部分序列的PCR扩增、克隆、序列测定及生物信息学分析。结果显示，在736份血样中，猪源附红细胞体阳性率为13.72％(101/756)，其中小附红细胞体阳性率为7.34％(54/736)，猪附红细胞体阳性率为4.76％(35/736)，混合感染比例为1.63％(12/736)，2个屠宰场3次采集的样品阳性率差异极显著（x2=132.841，P＜0.001）。嘉定区某屠宰场3月份的阳性率为2.41％，5月份的阳性率为33.21％，5月份极显著高于3月份（x2=81.484，P＜0.001）。
　　在DNA扩增阳性血样中，分别选取4份小附红细胞体引物扩增产物和4份猪附红细胞体引物扩增产物，亚克隆到pMD18-T载体后进行测序。小附红细胞体扩增片段序列完全一致，长度均为483 bp，BLASTn软件在线分析显示所获得序列与GenBank公布的小附红细胞体Indiana株16S rRNA基因（登录号:NR_121759）序列同源性达100％。猪附红细胞体扩增片段序列也完全一致，长度均为482 bp，BLASTn软件在线分析显示所获得序列与GenBank公布的猪附红细胞体Morioka5、6、8株16S rRNA基因（登录号分别为:AB610847、AB610848、AB610849）和ZJ NB01株16SrRNA基因（登录号:KC907396.1）序列同源性达100％，猪附红细胞体扩增片段与小附红细胞体扩增片段的同源性仅为93.6％。
　　用小附红细胞体阳性血样通过肌肉注射方法接种广西巴马去脾仔猪，采集血样进行特异性PCR检测及序列分析。结果表明:试验组5头仔猪中有2头在接种12d、5头在接种15d均检出小附红细胞体基因，人工感染猪血样与接种原血样DNA扩增产物基因序列完全一致。这证明已经成功建立了小附红细胞体人工感染猪的试验。
　　本研究通过试验数据证明了国内确实有猪感染小附红细胞体，小附红细胞体和猪附红细胞体在16sRNA基因片段上存在差异。通过人工肌肉接种，首次建立了小附红细胞体猪感染试验模型，为小附红细胞体的生物学特性和致病性研究打下了基础。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略表

第一章 文献综述

1 猪源附红细胞体病原学研究进展

1．1 病原分类

1．2 病原形态及分布

1．3 增殖

2 猪附红细胞体流行病学研究概述

3 附红细胞体病诊断手段的研究进展

3．1 形态学诊断

3．2 血清学诊断

3．3 分子生物学检测

4 小附红细胞体的研究概述

5 研究目的意义

第二章 猪源附红细胞体PCR检测方法的建立

1 实验材料

1．1 阳性质粒DNA

1．2 酶及试剂

1．3 主要仪器

2 实验方法

2．1 特异性引物设计

2．2 特异性试验

2．3 敏感性试验

3 试验结果

3．1 特异性试验

3．2 敏感性试验

4 讨论

5 小结

第三章上海地区猪源附红细胞体流行病学调查

1 实验材料

1．1 猪血液样品

1．2 主要药品及试剂

1．3 主要器材

2 实验方法

2．1 提取猪全血基因组DNA

2．2 两种猪源附红细胞体的特异基因扩增

2．3 两种猪源附红细胞体引物扩增阳性产物的纯化(胶回收)

2．4 两种猪源附红细胞体16S rRNA部分目的基因克隆

2．5 两种猪源附红细胞体16SrRNA目的基因的鉴定(菌液PCR)

2．6 小附红细胞体和猪附红细胞体16sRNA部分序列测序

3 结果

3．1 两种猪源附红细胞体16SrRNA的特异性引物扩增结果

3．2 两种猪源附红细胞体16SrRNA的目的基因的鉴定

3．3 测序结果及NCBI在线BLAST比对

3．4 上海地区猪源附红细胞体流行病学调查结果

4 讨论

5 小结

第四章 小附红细胞体人工感染猪模型初步建立

1 实验材料

1．1 猪小附红细胞体阳性血液样品制备

1．2 实验动物

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

2 试验方法

2．1 预试验

2．2 试验动物分组及处理

2．3 检测指标

2．4 血液基因组的提取

2．5 PCR检测

3 试验结果

3．1 临床表现

3．2 姬姆萨染色结果

3．2 血液PCR检测

4 讨论

全文结论

创新点

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文