油菜染色体加倍及倍性鉴定方法研究

摘要

本研究以甘蓝型油菜纯合品系(中双11、F009)、甘蓝型油菜杂交F1代(3828×0009、0009×3828)、甘蓝型油菜和白菜型油菜杂交F1代(0470×3383、0009×3383)为诱导加倍材料，以秋水仙素为主要化学诱导加倍试剂，使用植物组织培养和化学试剂诱导相结合的方法诱导上述材料染色体加倍;通过传统根尖细胞压片观察、形态学观察和流式细胞术检测等方法，对加倍处理材料进行倍性鉴定比较，并对流式细胞术检测油菜染色体倍性方法进行深入研究。其主要结果如下:
　　1.设置0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L五个浓度水平的秋水仙素梯度，在MS培养基上对受体材料种子进行加倍处理，记录并计算种子发芽率，存活率，加倍成功率，实验发现，实验材料随秋水仙素浓度的增高，种子发芽率和幼苗存活率逐渐降低，而加倍成功率逐渐上升;确定浓度60mg/L为油菜种子在培养基上的加倍最适浓度。
　　2.本实验中采用纯合甘蓝型油菜、杂交甘蓝型油菜、甘白种间杂交油菜三大类材料，通过实验发现，其中甘白种间杂交油菜对秋水仙素的耐受能力最强，有最高的发芽率、存活率和加倍成功率，是最适用于加倍的材料。
　　3.采用传统根尖压片计数染色体条数方法和流式细胞术检测法检测加倍处理材料染色体倍性，以根尖压片计数染色体方法为参考，确定流式细胞术检测油菜倍性的可靠性，并检测出三倍体甘白杂交油菜F1代成功加倍得到的六倍体油菜和四倍体杂交甘蓝型油菜F1代成功加倍得到的八倍体油菜。通过研究流式细胞术检测油菜染色体方法，探索出了一套适用于油菜倍性检测的技术体系:检测所需最佳试剂配方:MOPS20 mmol/L，柠檬酸钠30mmol/L，MgCl245 mmol/L，TritonⅩ-1000.2％(V/V)，β-巯基乙醇20ul/ml;检测样本最佳用量0.1g; DNA特异性染色液使用体积最佳为400ul、浓度最佳为100ug/ml、染色时间最佳为30min。
　　4.通过对加倍后代植株的形态观察发现，加倍成功植株表现为茎秆变粗壮，植株矮化，叶片皱缩，花蕾变大，花瓣、柱头和花药也都变大，加倍成功油菜花期延后;不能正常结实的三倍体甘白杂交油菜经加倍为六倍体能够结实，四倍体经加倍为八倍体后结实率降低，但种子千粒重增加约70％。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 油菜多倍体育种的意义

1．2 植物染色体加倍的方法

1．2．1 自然多倍体的挖掘

1．2．2 物理诱导加倍技术

1．2．3 化学诱导加倍技术

1．2．4 组织培养辅助染色体加倍技术

1．2．5 原生质体培养及体细胞融合的染色体加倍方法

1．3 化学诱导染色体加倍技术

1．3．1 常用诱导试剂

1．3．2 常用化学诱导方法

1．3．3 诱导材料的选择

1．3．4 处理浓度和时间

1．4 染色体倍性鉴定方法

1．4．1 利用多倍体植物的特征鉴定

1．4．2 传统倍性鉴定方法

1．4．3 流式细胞术倍性鉴定

1．5 本研究的目的和意义

2．材料和方法

2．1 材料

2．2 加倍处理方法

2．2．1 含秋水仙碱MS培养基制备

2．2．2 生根培养基制备

2．2．3 种子加倍处理

2．3．4 经加倍处理种子发芽后处理

2．3 染色体倍性鉴定

2．3．1 流式细胞术检测

2．3．2 根尖细胞压片观察

2．4 加倍油菜后代细胞学及形态学观察

2．4．1 花粉母细胞行为观察

2．4．2 花粉活力

2．4．3 形态学特征观察

2．5 数据处理分析

3 结果与分析

3．1 化学试剂加倍效果

3．1．1 不同秋水仙碱浓度下不同材料种子发芽率

3．1．2 不同秋水仙碱浓度下不同材料存活率

3．1．3 不同秋水仙碱浓度下不同材料加倍成功率

3．2 秋水仙碱最适浓度筛选

3．3 不同材料的加倍效果比较

3．4 流式细胞鉴定技术研究

3．4．1 最佳油菜样本用量

3．4．2 最适裂解液配方

3．4．3 DNA特异性染色液最适用量、浓度及染色时间

3．5 染色体倍性鉴定结果

3．5．1 流式细胞术检测结果

3．5．2 根尖细胞观察

3．6 加倍后代花粉活力及细胞学观察

3．7 加倍处理后油菜形态特征

3．7．1 秋水仙素对幼苗生长的影响

3．7．2 秋水仙素处理后植株形态特征

4 讨论

4．1 加倍受体材料的选择

4．2 秋水仙素对油菜染色体加倍效果分析

4．3 组培技术与化学诱导技术的结合

4．4 染色体倍性鉴定方法比较

4．5 油菜染色体加倍的应用

4．5．1 多倍体油菜材料的获得

4．5．2 加倍后易产生快速稳定材料

4．5．3 多倍体可以创造非整倍体

4．5．4 染色体多倍体化克服远缘杂交不孕不实性

参考文献

致谢