中华蜂内共生放线菌的分离、多样性及抗菌活性研究

摘要

放线菌是一类具有重大实用价值的微生物资源。因其能产生丰富的生物活性物质如:抗生素、酶抑制剂、有机酸、维生素等，使其在医药领域、农业领域、食品领域等有着极为广泛的应用。所以探索新型的能产生良好生物活性物质的放线菌资源是进行放线菌研究的重要内容。昆虫是自然界中种类最多的生物种群，且其都有与微生物共生的现象，可以预见昆虫体内放线菌在种类和功能上都会具有丰富的多样性。然而目前人们对昆虫内共生放线菌资源的探索还较少，因此具有很大的开发潜力。本实验以中华蜂(Apis cerana cerana Fabricius)作为研究对象，目的在于探索中华蜂可培养内共生放线菌的分离方法，研究其内共生放线菌的物种多样性和抗菌活性，挖掘更多有价值的微生物资源。
　　本实验选用以浓度为0.2％的ClO2（二氧化氯）为消毒剂作用60s的表面消毒方法，采用7种不同的分离培养基对中华蜂体内放线菌进行分离，共计得到161株菌，其中腐殖酸HV培养基培养出了48株菌，分出的菌株数量居于首位，而稀有放线菌出菌率最高的为M7培养基。根据菌落的形态和细胞特征观察结果，从分离得到的161株内共生放线菌中选取84株代表菌株进行多样性和抗菌活性研究。
　　对84株代表菌株，选用HhaⅠ、HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ四种限制性内切酶进行16S rRNA-RFLP分析，酶切后形成18种16S rRNA遗传类型，树状图显示代表菌株在57％的相似性上聚在一起，在93％的相似水平上，代表菌株分成了10个遗传群，其中群2为优势菌群，包含50株菌。综合菌株形态特征和16S rRNA基因酶切图谱分析，从10个遗传群中选取了16株代表菌株测定16S rRNA基因序列，结果表明从中华蜂样品中分离得到的放线菌分属于3个目、4个科中的4个属，包括链霉菌亚目(Suborder Streptomycineae)中链霉菌科(Streptomycetaceae)的链霉菌属(Streptomyces);小单孢菌亚目(Suborder Micromonosporineae)中小单孢菌科(Micromonosporacea)的小单孢菌属(Micromonospora);棒杆菌亚目(Suborder Corynebacterineae)中戈登氏菌科(Gordoniaceae)的戈登氏菌属(Gordonia)和拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)的拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)。SCAUEB4、SCAUED23、SCAUEB32这3株为潜在新种，需进一步研究。
　　选用2种病原真菌和2种病原细菌对84株代表菌株进行抗菌活性初探，结果表明31.0％、48.8％、27.4％、16.7％的代表菌株分别对大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、玉米弯孢病菌(Curvullaria lunata)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)有不同程度的抗菌活性，71.4％的代表菌株对至少1种病原菌展现出抑菌效果，而其中的14.3％对3种及3种以上的病原菌表现出了不同程度抑菌效果，展现出了广谱的抗菌活性。
　　本实验研究结果表明，分离方法的选择对昆虫体内放线菌的分离效果影响较大;此外中华蜂体内放线菌具有丰富的多样性，展现出了很好的抗菌活性，其在发现新型生物活性物质中具有很大的潜力。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 昆虫内共生菌研究进展

1．1．1 昆虫内共生菌简介

1．1．2 昆虫内共生菌生物多样性

1．1．3 昆虫内共生菌与宿主的关系及作用

1．2 昆虫内共生放线菌研究现状

1．2．1 放线菌简介

1．2．2 放线菌在微生物系统学中的地位

1．2．3 昆虫内共生放线菌的分离方法

1．2．4 昆虫内共生放线菌多样性研究方法

1．3 蜜蜂内共生菌的研究进展

1．4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 样品

2．1．2 培养基及抑菌剂的选择

2．1．3 病原菌株

2．1．4 供试试剂及主要仪器

2．2 中华蜂内共生放线菌的分离

2．2．1 样品的预处理

2．2．2 最适表面消毒方法的选取

2．2．3 中华蜂内共生放线菌的分离纯化及保藏

2．3 中华蜂内共生放线菌多样性分析

2．3．1 内共生放线菌的形态观察

2．3．2 代表菌株基因组DNA提取

2．3．3 代表菌株16S rRNA基因的PCR扩增

2．3．4 代表菌株的16S rRNA PCR-RFLP指纹图谱分析

2．3．5 16S rRNA基因全序列测定

2．3．6 16S rRNA序列分析及系统发育树构建

2．4 内共生放线菌抗菌活性初探

2．4．1 细菌指示菌的抗菌活性实验

2．4．2 病原真菌的指示菌的抗菌活性实验

3 实验结果与分析

3．1 最适表面消毒方法的确定

3．2 中华蜂内共生放线菌的分离

3．3 内共生放线菌形态特征

3．4 代表菌株基因组DNA提取

3．5 代表菌株16S rRNA基因PCR扩增

3．6 代表菌株16S rRNA PCR-RFLP分析结果

3．7 代表菌株16S rRNA基因序列分析结果

3．8 中华蜂内共生菌抗菌活性

4 讨论

4．1 中华蜂内共生放线菌分离方法

4．2 中华蜂内共生放线菌多样性

4．3 中华蜂内共生放线菌的抗菌活性

5 结论

6 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文