一个新的玉米启动子克隆及功能的初步验证

摘要

植物基因工程研究的中心内容之一是基因的表达和调控，启动子及其顺式作用元件在转录水平的调控上起重要作用，已经成为分子生物学研究的热点。目前，在植物转基因工程中最常用的启动子还是组成型启动子，驱动外源基因在所有组织器官中过量表达，对于选择标记基因等一些不需要过量表达的外源基因，不分空间和时间的过量表达，表达会大量消耗营养和能量，而抑制植物其他的生理代谢活动，影响植物正常生长发育，增加转基因植物的适应性代价。因此，为了克服组成型启动子的这些缺点，有时需要驱动外源基因在转基因植物特定时间及特定部位表达，并且启动活性适中的特异性启动子。
　　在对玉米PPR(Pentatricopeptide repeats)基因家族做全基因组分析时，我们发现其中一个序列编号为GRMZM2G129783的成员在叶片中有适中的特异性表达，推测该基因的启动子可能是一个启动活性适中的叶片特异性启动子。因此，本研究在生物信息学分析的基础上，克隆PPRGRZM2G129783基因全长启动子pPPR1830及其5'-端缺失不同顺式作用元件的序列片段，构建驱动GUS报告基因的表达载体，转化烟草，通过GUS组织化学染色和GUS酶活测定，初步验证其特异性启动子的功能。结果如下:
　　(1)荧光定量PCR检测表明，PPRGRMZM2G129783基因只在幼苗的茎叶中表达，在根部几乎不表达，推测该基因的启动子可能为绿色组织特异性启动子。
　　(2)利用PLACE和PlantCARE数据库，对PRGRMZM2G129783基因全长启动子pPPR1830进行序列分析发现，该启动子除含有TATAbox和Inr核心启动子元件外，还含有3-AF1 binding site、GT-1 motif、 G-box、I-box、CATT motif、-10promoter element、ATCT motif七种光应答相关元件;MBS、LTRE、ABRE、CGTCAmotif和ARF五种逆境诱导性相关元件，以及与根特异性表达相关的ROOTMOTIFTAPOX1元件。
　　(3)从玉米自交系B73基因组中克隆得到的PPRGRMZM2G129783基因的启动子，全长1830bp，命名为pPPR1830。根据序列分析结果，将全长启动子序列从5'-端截短成1387、437、146和128bp的不同长度序列，分别命名为pPPR1387、pPPR437、pPPR146和pPPR128，用以替换双子叶植物表达载体pRI201-AN-35S-GUS上的35S启动子，分别构建5个表达载体pRI201-AN-pPPR1830-GUS、pRI201-AN-pPPR1387-GUSpRI201-AN-pPPR437-GUS、 pRI201-AN-pPPR146-GUS和pRI201-AN-pPPR128-GUS。
　　(4)用上述5个表达载体分别注射烟草叶片，并以pR1201-AN-35S-GUS为阳性对照，通过GUS组织化学染色，检测GUS基因的瞬时表达，对不同长度启动子序列的转录活性做定性鉴定。结果表明，除全长启动子序列pPPR1830外，其他4种不同长度的启动子序列均能驱动GUS基因在烟草叶片中表达。
　　(5)用上述5个表达载体，并以pRI201-AN-35S-GUS为阳性对照，农杆菌介导法转化烟草，获得25个T0代阳性植株。其中pPPR1830转化5株，pPPR1387转化3株，pPPR437转化4株，pPPR146转化4株，pPPR128转化3株，阳性对照6株。
　　(6) GUS组织化学性染色和GUS酶活性检测表明，全长启动子序列pPPR1830和5'-端缺失的pPPR1387、pPPR437启动子序列在根、茎、叶中均能驱动GUS基因表达，但其活性均低于阳性对照35S。但pPPR146和pPPR128序列仅在茎和叶中有启动活性，而在根中没有启动活性。此外，全长启动子序列pPPR1830在根、茎、叶中的启动活性均低于5'-端缺失的pPPR1387启动子序列，在茎和叶中还低于pPPR437启动子序列。由此推断，在pPPR1830启动子的5'-端序列中可能存在负调控元件。
　　由此推断，pPPR1830可能是一个转录活性适中的单子叶植物组织特异性启动子，在其-397至-106 bp区段存在与根特异性表达相关的顺式作用元件ROOTMOTIFTAPOX1，5'-端序列中可能存在负调控元件，启动子活性适中的序列在-1346至-1799 bp之间，经进一步验证或改造后有望用于单子叶植物转基因研究。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 PPR(Pentatricopeptide repeats)基因家族的研究进展

1．2 植物启动子研究进展

1．2．1 启动子的概念

1．2．2 启动子的结构

1．2．3 启动子的分类

1．2．4 组织特异性启动子的应用

1．3 启动子的克隆方法

1．3．1 利用PCR技术克隆启动子

1．3．2 利用启动子探针质粒载体筛选启动子

1．3．3 利用启动子捕获方法分离和鉴定启动子

1．4 启动子的分析方法

1．4．1 生物信息学分析

1．4．2 瞬时表达

1．4．3 稳定转化表达

1．4．4 突变分析法

1．4．5 凝胶电泳迁移技术

1．4．6 足迹法

1．4．7 酵母单杂交技术

1．5 外源基因过量表达的危害

1．6 本实验的研究目的及意义

2 材料和方法

2．1 技术路线

2．2 实验材料

2．2．1 植物材料

2．2．2 菌株和载体

2．2．3 主要试剂

2．2．4 溶液

2．2．5 引物

2．3 实验方法

2．3．1 荧光定量PCR

2．3．2 提取玉米基因组DNA

2．3．3 启动子序列分析

2．3．4 引物设计

2．3．5 PCR扩增

2．3．6 构建pMD19-T-pPPR1830克隆载体

2．3．7 检测重组克隆载体

2．3．8 构建植物表达载体

2．3．9 植物表达载体转化农杆菌

2．3．10 瞬时表达

2．3．11 GUS组织化学染色

2．3．12 农杆菌介导烟草的遗传转化及转基因烟草阳性鉴定

2．3．13 GUS组织化学染色

2．3．14 GUS酶活性定量检测

3 结果与分析

3．1 PPRGRMZM2G129783基因的器官特异性表达

3．1．1 内参Actin基因和PPRGRMZM2G129783基因引物特异性

3．1．2 内参Actin基因和PPRGRMZM2G129783基因的标准曲线

3．1．3 PPRGRMZM2G129783基因在玉米不同器官中的表达量

3．2 PPRGRMZM2G129783基因上游的顺式作用元件

3．3 PPRGRMZM2G129783基因启动子全长序列

3．4 5’-端缺失启动子片段

3．5 不同长度启动子表达载体

3．6 不同长度启动子表达载体转化农杆菌菌株

3．7 不同长度启动子表达载体在烟草叶片中瞬时表达

3．8 转基因烟草的获得

3．9 不同长度启动子在转基因烟草中的启动活性

4 讨论

4．1 启动子的器官特异性受转基因受体的影响

4．2 不同生长发育阶段启动子的活性发生改变

4．3 pPPR1830启动子的器官特异性

4．4 有待研究的问题

参考文献

致谢