L-聚组氨酸抑制LPS引起的猪精子凋亡及其对精液品质的影响

摘要

猪精液液态保存是人工授精技术的基础，在精液液态保存过程中，精液中细菌溶菌产生的脂多糖(LPS)不仅能降低精液品质、缩短精子寿命、诱导精子凋亡，而且还能随着输精进入母畜生殖道内引起母畜生殖道免疫反应，造成生殖道免疫细胞极增而吞噬精子。L-聚组氨酸(L-pHis)能与LPS结合，但其能否抑制LPS对精子凋亡的影响尚未见报道。本研究中，通过向猪精液中添加L-pHis，检测其对猪精液细菌浓度、LPS浓度、精液品质是否造成影响，以及能否降低猪精子的凋亡率，并初步阐释其作用机制。
　　研究中共收集24头公猪的精液，每4～5个个体的精液混合形成5个样本池(n=5)，用BTS稀释液稀释至密度为4×106/mL，然后将精液液态保存(17℃)和37℃进行试验。首先在0、6、12、36、72、120h测定精液稀释后液态保存过程中精液中细菌菌落浓度以及精浆中LPS浓度随时间的变化;然后以稀释精液为对照组，分别添加多粘菌素B(PMB)至PMB浓度为100μg/mL为PMB组，L-聚组氨酸(L-pHis)至L-pHis为100μg/mL为L-聚组氨酸组，液态保存下于0、6、12、36、72、120h检测三个组中细菌浓度、LPS浓度、精液品质（精子活率、精子活力指数、运动速率）和精子的凋亡率，37℃保存下于0、1、3、6、9、12、24h检测三个组中精液品质（精子活率、精子活力指数、运动速率）和凋亡率;最后通过添加2μg/mL Anti-CD14于精液中，阻断LPS-TLR4的结合，初步阐释L-pHis抑制LPS诱导精子凋亡的作用机制。研究结果表明:(1)猪精液在液态保存过程中，细菌浓度从36h开始迅速增加，36h(4980±381.58 CFU/mL)、72h（12920±2833.66 CFU/mL）、120h(40020±4755.38 CFU/mL)细菌浓度持续显著增加(P＜0.05)，细菌平均浓度达到1.02×104 CFU/mL;精液LPS浓度随保存时间无显著性变化(P＞0.05)，其平均浓度达到4.70±0.21 EU/mL。(2)在精液稀释液中添加100μg/mL L-pHis或100μg/mL PMB对液态精液保存中LPS的浓度没有显著影响(P＞0.05)，但是它们能提高在液态保存和37℃下精液品质（精子活力指数、精子速率、精子活率）和降低精液细菌浓度。(3)液态保存和37℃保存下在精液稀释液中添加100μg/mL L-pHis和100μg/mL PMB均能显著抑制精子凋亡(P＜0.05)，但PMB抑制精子凋亡能力优于L-pHis(P＜0.05)。(4) L-pHis不能特异性清除精液中LPS，但是通过添加Anti-CD14或L-pHis后，LPS引起精子的凋亡率显著降低(P＜0.05)，L-pHis可能通过与TLR4结合，阻断LPS诱导的精子凋亡途径，降低了精子的凋亡。
　　结论:在精液液态保存中加入100μg/mL L-pHis能够有效提升精液品质，L-pHis能够阻断LPS诱导的精子凋亡从而降低精子凋亡率。

目录

论文说明

声明

摘要

1 文献综述

1．1 人工授精技术与精液液态保存

1．2 精液中病原性微生物对精子的影响

1．2．1 病原性微生物的来源及分类

1．2．2 革兰氏阴性菌对精液质量的影响

1．2．3 革兰氏阴性菌引起精子的凋亡

1．3 精液品质评定指标

1．3．1 常规指标

1．3．2 精子凋亡指标

1．4 精液中LPS对精子质量及母畜的影响

1．4．1 LPS对精液品质的影响

1．4．2 LPS引起母畜生殖道应急

1．4．3 LPS-TLR4信号传导机制

1．5 精液中清除LPS的研究进展

1．5．1 PMB清除LPS的研究

1．5．2 L-pHis清除LPS的研究

1．5．3 壳聚糖与TLR4竞争性结合

1．5．4 其它LPS-TLR4通路阻断剂

1．6 研究目的与意义

2．材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 药品及主要试剂的配制

2．2 实验步骤

2．2．1 精液的采集及稀释

2．2．2 试验设计

2．2．3 精液品质检测

2．3 数据处理

3 实验结果

3．1 精液液态保存过程中细菌浓度的变化

3．2 精液液态保存中LPS浓度的变化

3．3 L-pHis和PMB对精液品质的影响

3．3．1 L-pHis和PMB对精液中细菌增殖的影响

3．3．2 L-pHis和PMB对精子活力的影响

3．3．3 L-pHis和PMB对精子运动速率的影响

3．3．4 L-pHis和PMB对精子活率的影响

3．4 L-pHis和PMB对精子凋亡的影响

3．5 L-pHis抑制猪精子凋亡

3．5．1 LPS浓度测定

3．5．2 验证试验

4 讨论

4．1 BTS在猪精液液态保存中的应用

4．2 影响猪精液液态保存的因素

4．3 PMB对精液质量的影响

4．4 PMB的抗凋亡作用

4．5 L-pHis的抗凋亡作用

5．结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表文章