加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选猪卵母细胞脂肪沉积相关基因

摘要

脂滴作为细胞内储存能量的细胞器，能够调节脂肪酸的贮存和利用，进而调节能量平衡。并且具有信号转导、免疫等功能。在卵母细胞成熟、受精以及早期胚胎发育的过程中，脂滴是卵母细胞内内源性脂质的来源，为卵母细胞提供能量。但是卵母细胞内脂质的异常沉积提高卵母细胞冻存的敏感性，阻碍卵母细胞冻存。
　　本研究主要根据猪卵母细胞相比于其他哺乳动物卵母细胞高脂滴含量的生理特点，将其作为研究卵母细胞脂质沉积的模型，利用基因芯片数据对猪卵母细胞与颗粒细胞复合物转录组进行分析，探寻猪卵母细胞脂质沉积的分子机理。得到主要结果如下:
　　1.利用对猪卵母细胞的苏丹Ⅲ染色和油红O染色以及猪脂肪组织的HE染色，进一步验证了猪卵母细胞内脂滴含量丰富的生理学特点。
　　2.为了探究猪卵母细胞脂质沉积的相关分子机制，我们首先对猪8个组织(卵母细胞卵丘细胞复合体(COCs)、脂肪、肌肉、肝脏、肺、肾脏、血液、睾丸）进行了非监督层次聚类分析，通过聚类分析发现卵母细胞卵丘细胞复合体(COCs)与脂肪组织属于同一个分支下而与其他组织分开。同为生殖相关的睾丸与卵母细胞卵丘细胞复合体聚类距离较远。说明猪卵母细胞卵丘细胞复合体与脂肪组织在表达模式上与其他组织相比更为相似。可能在脂质沉积方面存在相似之处。
　　3.为进一步探究卵母细胞与脂肪组织的相似之处，我们利用WGCNA的分析方法，对猪不同部位的8个组织进行加权基因共表达网络分析，探寻不同组织特异表达模块以及脂滴沉积相关模块。最终分别在卵母细胞、脂肪、睾丸、肺、血液、肌肉中找到了组织特异的模块。并且组织特异模块相关系数普遍达到了0.8以上，个别模块相关系数达到了0.95以上，说明组织特异性模块在该组织中相对特异性表达。通过对特异模块进行功能富集分析，我们发现不同的组织相关模块，在功能富集分析上与该组织生物学功能密切相关。进一步证明了该方法具有较高的可靠性。
　　4.最终找到一个与脂滴沉积表型高度相关的包含34个基因的模块(r=0.9)。对该模块的功能富集分析发现其主要富集在脂肪代谢过程、磷脂代谢等方面，与脂滴形成过程相关。在这34个皋因中包含5个基因卵母细胞与脂肪组织特异性表达。
　　5.为进一步缩小筛选基因范围，我们对脂滴相关模块进一步分析，找到10个与模块内其他基因相比具有较高连接度的枢纽基因。在这10个枢纽基因中有4个基因卵母细胞与脂肪组织共同高表达，并且比其他6个组织显著高表达，8个枢纽基因是已经报道的与脂肪代谢、脂滴形成、肥胖相关。其中包含脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase(FASN))、组织蛋白酶K(cathepsinK(CTSK))、白介素6(IL6)、围脂滴蛋白(PLIN1，又称Perilipin)、ATP citrate lyase(ACLY)等这些已经熟知的与脂肪代谢密切相关的基因。另外两个基因TMEM229A和PATL1日前没有相关报道与脂滴形成相关，可以重点作为下一步与脂滴沉积相关研究的目的基因。
　　以上结果揭示了猪卵母细胞与脂肪组织在脂质沉积方面的共表达模式。我们最终找到了与脂滴沉积相关的模块，并且筛选得到一些可能与卵母细胞脂肪沉积的基因。为进一步探究卵母细胞脂质沉积提供目的基因。

目录

论文说明

声明

摘要

高频词对照表

1 文献综述

1．1 研究背景

1．2 细胞内脂滴研究进展

1．2．1 脂滴的起源

1．2．2 脂滴的形成过程

1．2．3 脂滴的动态过程

1．2．4 脂滴的生物学功能

1．2．5 脂滴对卯母细胞的影响

1．3 WGCNA研究进展

1．3．1 共表达网络分析基本思想

1．3．2 WGCNA算法基础

1．3．3 WGCNA构建网络步骤

1．4 研究目的与意义

2 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验仪器与主要试剂

2．1．3 实验试剂

2．1．4 常用实验试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 样本采集

2．2．2 卯母细胞形态学观察

2．2．3 猪皮下白色脂肪及小鼠棕色脂肪形态学观察

2．2．4 总RNA提取

2．2．5 总RNA质检

2．2．6 芯片杂交与处理

2．2．7 差异基因及聚类分析

2．2．8 模块内基因功能聚类分析

3 实验结果

3．1 猪卵母细胞脂滴表型分析

3．2 表达谱芯片数据预处理与重注释

3．3 不同组织的表达谱芯片数据层次聚类分析

3．4 猪卵母细胞与脂肪细胞共同特异表达基因

3．5 基因共表达网络分析

3．5．1 去除离群样本

3．5．2 确定软阈值

3．5．3 识别基因共表达模块

3．5．4 模块与性状之间的关系

3．5．5 相关模块功能聚类分析

3．5．6 脂滴沉积相关模块枢纽基因

4 讨论

4．1 芯片的重注释与数据预处理

4．2 卵母细胞与脂肪组织共同特异表达基因

4．3 脂滴表型相关模块

4．4 猪卵母细胞与脂肪组织脂滴的异同

5 结论

参考文献

致谢

附录