鹅Ⅰ型和Ⅱ型干扰素免疫学特性及抗病毒功能研究

摘要

干扰素(IFN)是一类有效的抗病毒免疫蛋白，在外来病毒感染宿主的过程中，干扰素与其同源受体发生结合而活化特定的STAT分子从而启动干扰素刺激基因的转录和表达。本研究对鹅Ⅰ型和Ⅱ型干扰素受体(IFNR)进行了基因鉴定，探究了IFNα、IFNγ及其同源受体组织表达规律，并成功表达鹅IFNα、IFNγ重组蛋白，从干扰素及相关免疫信号因子调控、病毒感染及抗原定位、干扰素抗病毒效应等多方面解析了鹅干扰素免疫学活性和抗病毒功能。获得结果如下：
　　1.Ⅰ型与Ⅱ型干扰素受体的分子克隆
　　本研究通过cDNA末端快速扩增技术克隆了四川白鹅IFNAR1(1616 bp)、IFNAR2(1525 bp)、IFNGR1(1322 bp)、IFNGR2(1438 bp)基因的全序列，上传至NCBI获得Genbank序列号为IFNAR1(KM504097)、IFNAR2(KM504096)、IFNGR1(KM457284)、IFNGR2(KM461716)。经蛋白结构域分析及分子进化树分析表明禽类干扰素受体分子结构相似，进化关系接近。
　　2.Ⅰ型与Ⅱ型干扰素及其受体的组织表达谱与免疫学特性研究
　　采用荧光定量PCR检测方法对1周龄雏鹅探究了IFN及其受体免疫基因的组织表达谱，分析发现IFNα、IFNγ及其受体亚基在免疫相关组织中表达较高。在体外实验中，不同的免疫激动剂均可上调鹅外周血淋巴细胞中干扰素基因的表达量，证明了鹅Ⅰ型与Ⅱ型干扰素对TLRs激动剂的免疫特性。
　　3.H9N2、TMUV、GPV病毒感染对干扰素表达的影响
　　利用H9N2、GPV和TMUV人工感染雏鹅，通过免疫组化和荧光定量PCR技术分别检测了不同器官的抗原信号和干扰素转录水平。H9N2禽流感病毒的抗原信号在脾脏、法氏囊、小肠、大肠、肺脏、气管和肝脏中明显。GPV感染组中，在肝脏、肺脏、小肠、大肠、均有较强的GPV信号。TMUV感染组中，肝脏、脑、脾脏、小肠均检测到较强的TMUV阳性信号与CD8阳性信号。在感染GPV或TMUV试验动物中，IFNγ在免疫组织（脾脏、胸腺、哈德氏腺）和非免疫组织（小肠、肝脏、肺脏）的表达量均高于对照组，且鹅IFNγ与CD8和病原阳性信号分布和强度相关联。此外，H9N2、GPV或TMUV病毒孵育外周血淋巴细胞后，均能显著上调IFNα与IFNγ的表达。
　　4.Ⅰ型与Ⅱ型干扰素蛋白的亚细胞定位研究
　　以荧光质粒作为骨架载体，重组质粒pEGFP-IFNα和pEGFP-IFNγ成功构建并在BHK21细胞中有效表达，其大小分别约为46 kDa和44 kDa。IFNα蛋白主要以点状、环状、聚集状，分布于细胞核周围。IFNγ蛋白主要表现为点状、团状、散在的星状结构，广泛分布于细胞核和细胞质。
　　5.真核表达质粒的构建和重组蛋白的表达
　　经PCR和酶切鉴定，表明pcDNA3.1-IFNα与pcDNA3.1-IFNγ质粒构建成功。对体外培养BHK21细胞转染质粒，并经免疫印迹验证确认pcDNA3.1-IFNα与pcDNA3.1-IFNγ质粒可在BHK21细胞中成功表达，重组鹅IFNα与IFNγ蛋白分别约为20 kDa和18 kDa，重组蛋白均在转染24小时后表达量较高。
　　6.鹅Ⅰ型与Ⅱ型干扰素蛋白的抗病毒活性研究
　　运用免疫印迹、定量PCR和流式细胞仪分析技术，对鸭瘟病毒的标签荧光蛋白、病毒拷贝数、病毒滴度进行测定，发现外源鹅Ⅰ型与Ⅱ型干扰素蛋白均可有效抑制鸭瘟病毒在DEF中的增殖和复制，证明了鹅Ⅰ型与Ⅱ型干扰素蛋白具有抗病毒功能。另外，鹅源干扰素可诱导鸭源细胞中干扰素及其抗病毒基因的转录上调，表明其在鸭源细胞中也具有生物学活性。本研究为进一步研究重组鹅干扰素的抗病毒功能及其应用奠定了基础。

目录

声明

摘要

英语缩写词汇及其符号说明

第一章 文献综述

1 IFN及其特异受体

1．1 IFN

1．2 IFNR

2 IFN介导的抗病毒信号通路

2．1 JAK-STAT通路

2．2 IRF调控因子

2．3 正反馈调控机制

3 IFN诱导的主要抗病毒蛋白

3．1 PKR

3．2 OAS

3．3 Mx

3．4 Viperin

4 Ⅰ型和Ⅱ型IFN免疫活性及抗病毒活性

5 研究目的和意义

第二章 鹅IFNα和IFNγ受体的分子克隆

1 材料

1．1 菌株与质粒

1．2 实验动物

1．3 实验试剂

1．4 主要溶液及其配制

1．5 主要仪器设备

2 方法

2．1 引物的设计与合成

2．2 保守区克隆

2．3 序列末端克隆

2．4 生物信息学分析

3 结果

3．1 保守序列扩增电泳结果

3．2 基因全长序列扩增电泳结果

3．3 核酸与氨基酸序列分析

3．4 结构域分析

3．5 系统进化分析

4 讨论

第三章 鹅IFN及其受体的组织表达谱与免疫特性研究

1 材料

1．1 主要实验试剂

1．2 实验动物

1．3 主要仪器设备

2 方法

2．1 组织分离及研磨

2．2 总RNA抽提

2．3 反转录

2．4 外周血淋巴细胞分离

2．5 荧光定量PCR

3 结果

3．1 Ⅰ型与Ⅱ型干扰素及其受体组织表达谱

3．2 Ⅰ型与Ⅱ型干扰素体外免疫特性

4 讨论

第四章 不同病毒感染对鹅干扰素表达的影响

1 材料

1．1 实验毒株与动物

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 实验设计

2．2 组织样本采集

2．3 免疫组化染色

3 结果

3．1 H9N2病毒抗原定位与干扰素的表达

3．2 TMUV与GPV病毒抗原定位与干扰素的表达

4 讨论

4．1 H9N2感染对宿主抗病毒免疫反应的影响

4．2 TMUV与GPV感染对宿主抗病毒免疫反应的影响

第五章 鹅IFINα和IFNγ的亚细胞定位

1 材料

1．1 质粒和试剂

1．2 仪器和设备

2 方法

2．1 引物设计

2．2 质粒构建

2．3 质粒抽取

2．4 细胞转染

2．5 爬片制作

2．6 免疫印迹

3 结果

3．1 荧光质粒的鉴定

3．2 IFNα和IFNγ的亚细胞定位

3．3 IFNα和IFNγ的免疫印迹

4 讨论

第六章 鹅Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素的真核表达与鉴定

1 材料

1．1 质粒与细胞

1．2 实验试剂

2 方法

2．1 引物设计

2．2 产物连接转化

2．3 重组质粒鉴定

2．4 质粒转染

2．5 免疫印迹

3 结果

3．1 真核表达质粒的鉴定

3．3 蛋白的表达鉴定

4 讨论

第七章 鹅Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素的抗病毒效应研究

1 材料

1．1 鸭胚

1．2 细胞与病毒

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

2 方法

2．1 GFP荧光强度观察

2．2 病毒基因拷贝数的检测

2．3 TCID50的测定

2．4 流式细胞仪的分析

2．5 免疫印迹

2．6 免疫基因的检测

3 结果

3．1 病毒荧光强度观察

3．2 病毒拷贝数检测

3．3 病毒滴度检测

3．4 流式细胞仪分析

3．5 免疫印迹分析

3．6 抗病毒免疫小分子变化规律

3．7 剂量依赖的鹅IFNα与IFNγ抗病毒效果

4 讨论

小结

参考文献

致谢