鸭肠炎病毒编码microRNAs靶基因的预测及dev-miR-D13-5p对病毒增殖影响的初步研究

摘要

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，又称鸭瘟病毒(duck plague virus, DPV)，是一种导致鸭高传染性、高死亡率的α-疱疹病毒。microRNA(miRNA)为内源性的非编码单链小RNA分子，长度约22个核苷酸，通过与靶基因mRNA相互作用调节基因的表达，在调节病毒生活周期、促细胞存活、免疫逃避和肿瘤发生等方面发挥重要作用。鸭肠炎病毒编码成熟的miRNAs，但对其调控机制我们却未见报道。本文利用生物信息学方法预测了鸭肠炎病毒编码的33个miRNAs靶基因，并对dev-miR-D13-5p部分靶基因进行了验证及其对病毒增殖的影响进行了探讨，结果报道如下:
　　1.DEV miRNAs靶基因的预测
　　通过生物信息学软件RNAhybrid、miRanda和Targetscan预测33个DEV miRNAs的靶基因，得到其可能潜在调节40多个DEV基因和900多个宿主基因。利用Cytoscape软件绘制DEV miRNAs和宿主mRNA的互作网络。为了更进一步探索DEV miRNAs的功能，Ensemble数据库下载宿主靶基因的GO(Gene Ontology)注释，WEGO生成宿主靶基因GO分类注释图，GO分析揭示902个宿主靶基因映射到42个GO分类，包括11个细胞组分、10个分子功能和21个生物学过程;另外，DAVID分析宿主靶基因的KEGG通路，902个宿主基因只有一小部分富集于11个信号通路，其中MAPK信号通路富集基因最多。
　　2.dev-miR-D13-5p靶基因的验证
　　为了探究DEV miRNA对病毒增殖的影响，选择与病毒复制靶基因UL8(OPF)和UL93'UTR紧密相关的dev-miR-D13-5p为研究对象。本研究首先成功构建dev-miR-D13-5p靶基因双荧光素酶报告基因野生型载体pmirGLO-UL8(wt)和突变型载体pmirGLO-UL8(mut)，然后dev-miR-D13-5p mimic、NC mimic分别与靶基因野生型和突变型载体共转染COS7细胞，48 h后检测萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性，并计算两者荧光素酶活性的比值，结果野生型试验组(0.3076±0.0289)和对照组(0.4753±0.0497)相比，差异极显著(P＜0.01);突变型试验组(0.4119±0.0147)和对照组(0.4582±0.0435)相比，差异不显著(P＞0.05);野生型试验组(0.3076±0.0289)和突变型试验组(0.4119±0.0147)相比，差异极显著(P＜0.01)。表明dev-miR-D13-5p能与UL8(ORF)或UL93'UTR相互作用。
　　3.dev-miR-D13-5p对靶基因转录水平和病毒增殖的影响
　　构建dev-miR-D13-5p靶基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-UL8(ORF)和pcDNA3.1(+)-UL9(ORF+3'UTR)，分别将dev-miR-D13-5p mimic、NC mimic与pcDNA3.1(+)-UL8(ORF)和pcDNA3.1(+)-UL9(ORF+3'UTR)共转染COS7细胞，48 h后分别进行荧光定量PCR检测UL8、UL9基因的水平，探讨dev-miR-D13-5p mimic对靶基因转录水平的影响。结果显示，与NC mimic组相比，dev-miR-D13-5p mimic组UL8 mRNA的表达量下调79.91％，方差分析差异极显著(P＜0.01); dev-miR-D13-5pmimic组UL9 mRNA的表达量几乎无变化，方差分析差异不显著(P＞0.05)。据此表明dev-miR-D13-5p能抑制UL8 mRNA水平，但对UL9 mRNA水平影响不显著。
　　为探究dev-miR-D13-5p对病毒增殖的影响，将鸭胚成纤维细胞(DEF, duckembryo fibroblast)接种至24孔培养板中，一段时间后转染dev-miR-D13-5p mimic、NC mimic，转染12h后感染DEV，并于感染DEV后24h、48h及72h后收集细胞病毒液，绝对荧光定量法检测DEV DNA的拷贝数。结果显示，24 h和48 h时dev-miR-D13-5p mimic组（24 h,5.19×104 copies/μl;48h,1.54×105 copies/μl）与NC mimic组(24 h，4.83×104 copies/μl;48h，2.28×105copies/μl)相比，差异均不显著(P＞0.05);72 h时，dev-miR-D13-5p mimic组(5.86×105 copies/μl)显著低于(P＜0.05)NC mimic组(2.57×106copies/μl)，表明dev-miR-D13-5p能抑制DEV的增殖。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviations)

第一部分 文献综述

1 疱疹病毒miRNAs影响病毒的裂解／潜伏状态

2 疱疹病毒miRNAs影响细胞凋亡及细胞分化

3 疱疹病毒miRNAs影响肿瘤发生

4 疱疹病毒miRNAs影响免疫反应

5 疱疹病毒miRNAs的其他功能

6 展望

7 研究目的及意义

第二部分 试验研究

第一章 鸭肠炎病毒miRNAs靶基因的预测

1 数据来源及材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结论

第二章 dev-miR-D13-5p靶基因的验证及其对靶基因转录水平和病毒增殖的影响

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间完成的学术论文