鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其CRISPR位点的分布和结构特征

摘要

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,PM）是一种引起畜禽发生出血性败血症或传染性肺炎的病原菌，可在多种健康动物的口腔、咽部黏膜中存活。该菌广泛分布于世界各地，对养鸭业造成重大经济影响。由于抗生素滥用，使该菌耐药情况愈来愈严重。耐药基因的水平转移是多杀性巴氏杆菌获得耐药性的主要方式之一，而原核细胞中发现的CRISPR-Cas系统，能有效阻止基因水平转移。为今后深入探究多杀性巴氏杆菌中CRISPR-Cas系统与其耐药性之间的关系，本课题首次对多杀性巴氏杆菌中CRISPR序列结构进行解析，并初步探讨了CRISPR位点与多杀性巴氏杆菌耐药情况之间的关系。
　　本研究首先对来自4个不同规模化鸭场的疑似禽霍乱病料剖检，病鸭呈全身出血性败血症，心外膜、心冠脂肪大面积出血，全身黏膜、浆膜点状出血，肝脏有针尖状白色坏死灶等典型症状。经麦康凯培养基筛选、革兰染色、PCR、Biolog全自动微生物鉴定系统，获得4株临床分离株均为多杀性巴氏杆菌，经K-B纸片药敏实验均表现为多重耐药。
　　为进一步分析多杀性巴氏杆菌中CRISPR-Cas系统序列结构，先后提取4株临床分离株及7株实验室保存的多杀性巴氏杆菌全基因组，进行高通量测序，同时从NCBI下载11株多杀性巴氏杆菌全基因组序列，对总共22株多杀性巴氏杆菌基因组上的CRISPR-Cas系统进行比对。通过CRISPR-Cas系统分布情况，以及对先导序列、重复序列、间隔序列的分析，结果表明，在22株多杀性巴氏杆菌基因组上存在三种类型的CRISPR-Cas系统:Ⅰ-F型、Ⅱ-C型和Ⅲ-U型，且存在以下特征:1、每种CRISPR-Cas系统中，先导序列、重复序列及Cas蛋白三者之间相互影响;2、Ⅰ-F型系统中，重复序列第4位碱基突变对二级结构影响最大，Ⅲ-U型系统中，重复序列第9位碱基突变对二级结构影响最大;3、在三种系统中，共1314个间隔序列，但仅一例多杀性巴氏杆菌噬菌体F108与间隔序列匹配;4、不同地理位置分离的菌株，所包含的间隔序列数量存在差异。同时，为了解目前生产中多杀性巴氏杆菌的耐药情况与CRISPR位点之间的联系，本研究着重分析了4株临床分离株，结果显示间隔序列越少，菌株耐药性越强。
　　本次研究对以后深入分析生产中多杀性巴氏杆菌的CRISPR-Cas系统与细菌耐药机制，特别是基因水平转移情况有重要意义，同时也为研究CRISPR与细菌毒力之间的关系、流行病检测、Cas蛋白等有关应用提供基础依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 文献综述

1 多杀性巴氏杆菌研究概况

1．1 多杀性巴氏杆菌分类地位

1．2 多杀性巴氏杆菌形态及染色特性

1．3 多杀性巴氏杆菌培养及生化特性

1．4 多杀性巴氏杆菌血清型

1．5 多杀性巴氏杆菌抵抗力

1．6 多杀巴氏杆菌的致病性

1．7 多杀巴氏杆菌的流行病学

1．8 多杀性巴氏杆菌基因组学研究概况

2 CRISPR-Cas系统研究概况

2．1 CRISPR-Cas系统研究进展

2．2 先导序列

2．3 重复序列

2．4 间隔序列

2．5 Cas蛋白家族及CRISPR-Cas系统的分布及分类

2．6 CRISPR-Cas系统的作用机制

2．7 CRISPR-Cas系统与噬菌体的共进化

2．8 CRISPR-Cas系统的生物信息学分析

3 研究目的及意义

第二部分 鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

1 试验材料

1．1 菌株

1．2 主要材料

2 实验方法

2．1 临床分离株的分离培养及纯化

2．2 临床分离株的革兰染色

2．3 Biolog全自动细菌鉴定仪鉴定

2．4 16S rDNA分子生物学鉴定

2．5 Kirby-Bauer(K-B)药敏实验

3 结果

3．1 分离结果

3．2 培养特性

3．3 革兰染色结果

3．4 Biolog全自动细菌鉴定结果

3．5 PCR鉴定结果

3．6 耐药结果

4 讨论

第三部分 鸭源多杀性巴氏杆菌中CRISPR-Cas系统的生物信息学分析

1 11株多杀性巴氏杆菌全基因组测序

1．1 高质量细菌基因组DNA的制备

1．2 基因组测序方法

1．3 主要仪器、软件及网站

2 CRISPR-Cas系统的生物信息学分析结果

2．1 测序结果

2．2 CRISPR位点的分布

2．3 先导序列的分析

2．4 重复序列的分析

2．5 间隔序列的分析

2．6 Cas蛋白基因簇的分析

3 讨论

3．1 多杀性巴氏杆菌中CRISPR-Cas系统序列结构特征

3．2 CRISPR位点与菌株耐药关系的初步探讨

结论

参考文献

致谢