鸭疫里默氏杆菌B739_1208基因的功能鉴定及其突变株的毒力评估

摘要

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）是一种革兰氏阴性菌，是当前影响世界养鸭业最常见的病原菌之一，可以感染1-8周龄的雏鸭、鹅、鸡等多种家禽和鸟类，感染该菌主要引起以浆膜炎为主要特征的急性或慢性败血症，从而导致雏鸭大量死亡或生长缓慢，严重影响养鸭业的健康发展。铁是几乎所有的生命体包括细菌必需的一种营养元素，它是许多蛋白和酶的重要辅助因子，它参与了电子传递、核酸合成和氧化还原反应等生命过程。致病菌为了达到感染宿主的目的，进化产生了多种机制来获得宿主体内的铁离子，由于这些铁离子获取机制与细菌的毒力息息相关，因而，可构建铁离子转运相关基因敲除弱毒株作为一种潜在的弱毒疫苗来评价。本研究的主要结果如下:
　　1.鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株B739_1208基因缺失株的构建
　　序列分析表明，鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1 B739_1208基因可能与铁离子利用相关，且其同源基因存在于所有的鸭疫里默式杆菌菌株中。为了研究该基因功能，需要构建该基因的缺失株。首先，设计引物，扩增B739_1208的左右两侧同源臂基因与壮观霉素抗性基因盒片段，用酶切连接的方法将这三段连接在一起，再将该连接片段与自杀质粒pEX18Gm连接，成功构建了重组自杀载体;将重组自杀质粒转化入接合转移供体菌E.coli S17-1，将该菌与RA-CH-1做接合转移，以卡那霉素和壮观霉素筛选阳性接合子，再通过多重PCR的方法对阳性克隆进行鉴定，成功构建了缺失株B739_1208ΔB739_1208。生长曲线测定结果可知，与野生株相比，B739_1208ΔB739_1208在TSB液体培养基中的生长速度明显减慢。
　　2.鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1 B739_1208基因功能的鉴定
　　在铁离子限制性环境下比较RA-CH-1ΔB739_1208基因敲除株和亲本株的生长情况，发现敲除株在低铁条件下的生长情况受到了严重抑制，表明B739_1208基因与铁离子的转运相关;但是，缺失株对于血红素的利用能力却增强，这可能是该基因的缺失导致血红素转运相关基因的转录增强所致。通过荧光定量PCR检测RA-CH-1 B739_1208基因在富铁环境及铁离子限制环境的转录水平，结果显示该基因的转录并不受环境中铁离子的调控。
　　3.鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1ΔB739_1208基因缺失株毒力的评估
　　比较以109 CFU的RA-CH-1野生株和RA-CH-1ΔB739_1208基因敲除株分别攻毒3日龄雏鸭后的死亡情况，得知突变株对雏鸭的致死率下降了约50％;随后，分别测定了两种菌对于3日龄雏鸭的半数致死量，结果表明突变株的半数致死量上升了十几倍，即其毒力下降了十几倍;以109 CFU的RA-CH-1野生株和RA-CH-1ΔB739_1208基因敲除株混合感染3日龄雏鸭，研究两种菌在雏鸭体内的竞争情况，结果显示，突变株在体内的竞争力明显减弱;最后，以109 CFU的两种菌分别攻毒3日龄雏鸭，24 h和48 h后分离并计算其各个器官中细菌的载量，发现突变株的细菌载量远低于野生株。综上这些试验，初步表明了RA-CH-1ΔB739_1208基因敲除株相比于野生株，毒力有所减弱。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 文献综述

1 鸭疫里默氏杆菌研究概况

2 细菌铁摄取机制研究进展

2．1 三价铁离子转运系统

2．2 血红素转运系统

3 细菌铁离子转运系统参与宿主致病研究进展

4 宿主针对细菌铁离子摄取的抗感染免疫

5 研究的目的和意义

第二部分 试验部分

第一章 鸭疫里默氏杆菌B739_1208基因缺失株的构建

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

5 结论

第二章 鸭疫里默氏杆菌B739_1208基因功能的初步鉴定

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

5 结论

第三章 鸭疫里默氏杆菌B739_1208基因缺失株的毒力评估

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

附录

攻读学位期间发表的学术论文