三种玉米miRNAs在猪体内、外的吸收规律研究

摘要

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类长约20～25nt非编码RNA，参与调控真核生物体内30％-90％基因，涉及生长、发育、疾病发生等多个病理和生理过程。近年研究表明某些植物miRNAs能通过动物消化道吸收入血，并随血液循环分布至各个组织器官，参与调控动物体内的部分基因的翻译过程。如南京大学张辰宇课题组首次证明大米MIR168a能够被小鼠消化道吸收，并在肝脏中富集，与小鼠的LDLRAP1mRNA靶向结合，从而抑制其在肝脏中的表达，使LDL在血液中的清除速率减缓。玉米作为猪饲料中的重要原料之一，其中所含的miRNAs能否通过消化道吸收并参与调控猪的生理功能？为解释上述问题，本试验选用猪作为试验动物，先利用翻转肠囊法研究了猪小肠对新鲜玉米和人工合成玉米miRNAs（MIR164a-5p，MIR167e-5p和MIR168a-3p）的吸收规律，后通过给猪灌喂上述3种人工合成玉米miRNAs，收集实验猪不同时间点血浆，并于灌喂24h后屠宰并采集组织样品，采用stem-loopRT-PCR方法检测不同时间点的血浆以及各组织中玉米miRNAs的含量。试验结果如下:
　　1.离体肠段对新鲜玉米miRNAs和人工合成的玉米miRNAs的吸收均呈先升高降低或持续升高的规律。肠囊内液中玉米miRNAs与肠囊外液中玉米miRNAs浓度成正相关。在玉米汁组中，MIR164a-5p在1h时空肠中的浓度达到最高(6.24fmol/ml)，为0h时浓度的(2.58fmol/ml)2.42倍(p＜0.05);MIR167e-5p在2h时回肠中的浓度达到最高（8.11fmol/ml），为0h时浓度(6.39fmol/ml)的1.27倍(p＞0.05);MIR168a-3p在2h时空肠中的浓度达到最高(10.41fmol/ml)，为0h时浓度的(8.40fmol/ml)1.24倍(p＞0.05)。在人工合成miRNA组中，MIR164a-5p在2h时空肠中的浓度达到最高(69.74fmol/ml)，为0h时浓度的(21.68fmol/ml)3.22倍(p＜0.05);MIR167e-5p在0.5h时空肠中的浓度达到最高（14.08fmol/ml），为0h时浓度的(5.9fmol/ml)2.39倍(p＜0.05);MIR168a-3p在2h时回肠中的浓度达到最高(35.78fmol/ml)，为0h时浓度的(19.84fmol/ml)1.8倍(p＜0.05)。空肠和回肠吸收玉米miRNAs的速度快于十二指肠。
　　2.灌喂人工合成的玉米miRNAs3h后，猪血浆中玉米MIR168a-3p含量达到最高，但与灌喂前(0h)相比，差异不显著(p＞0..05)，随后其含量逐渐降低;而猪血浆中玉米MIR164a-5p和MIR167e-5p含量在灌喂6h后分别达到49.19fmol/ml和19.09fmol/ml，显著高于灌喂前(0h)(p＜0.05)。血浆中三种玉米miRNAs含量均呈现出先升高后降低的趋势。
　　3.灌喂人工合成玉米miRNAs24h后，猪组织中三种玉米miRNAs浓度在0.05-0.8fmol/g之间，约为内源ssc-MIR16浓度的0.1‰-3％。各组织间玉米miRNA含量存在差异，MIR164a-5p在眼肌中含量最高（0.21fmol/g），在肺脏中最低（0.11fmol/g）;MIR167e-5p在心脏中浓度最高（0.79fmol/g），在背部皮下脂肪中最低（0.16fmol/g）;MIR168a-3p在心脏中浓度最高（0.04fmol/g），其余组织含量均较低。
　　结论:在体实验和离体实验均表明所选玉米miRNA可通过消化道吸收，并呈现先升高后降低或者持续升高的变化规律;玉米miRNAs在组织中的分布呈现组织特异性;玉米miRNA在空肠和回肠吸收速率更高。

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1．文献综述

1．1 miRNA研究进展

1．1．1 miRNA简介

1．1．2 miRNA生物学特性

1．2 动植物miRNA区别

1．2．1 动植物miRNA结构

1．2．2 动植物miRNA生成过程

1．2．3 动植物miRNA作用机制

1．3 小RNA跨物种研究进展

1．3．1 miRNA跨物种传递研究进展

1．3．2 植物miRNA稳定性研究

1．3．3 miRNA跨物种传递机制

1．4 miRNA检测技术研究进展

1．4．1 miRNA高通量测序

1．4．2 定量-逆转录PCR(qRT-PCR)

1．4．3 微滴式数字PCR(DD- PCR)

1．5 翻转肠囊法

1．6 本试验目的及意义

2．材料和方法

2．1 试验试剂和仪器设备

2．1．1 试验仪器

2．1．2 试验试剂

2．1．3 主要试剂配制

2．2 试验动物

2．3 离体试验

2．3．1 翻转肠囊制备

2．3．2 翻转肠囊实验装置改进

2．3．3 翻转肠囊通透性检测

2．3．4 翻转肠囊内、外液采集

2．3．5 总RNA提取

2．3．7 miRNA标准品的稀释

2．3．8 miRNA的反转录

2．3．9 实时荧光定量PCR

2．4 在体试验

2．4．1 血浆和组织样品采集

2．4．2 总RNA提取

2．4．3 miRNA的反转录

2．4．4 实时荧光定量PCR

2．5 数据处理

3．结果分析

3．1 标准曲线的建立

3．2 扩增产物的特异性

3．3 两种miRNA提取方法比较

3．4 翻转肠囊法研究玉米miRNA吸收规律

3．4．1 翻转肠囊通透性

3．4．2 翻转肠囊吸收动力学研究

3．4．3 翻转肠外液中玉米miRNAs变化规律

3．5 猪血浆中玉米miRNAs浓度

3．6 组织样品中玉米miRNAs分布规律

4．讨论

4．1 miRNA抽提效率的影响因素

4．2 miRNA检测方法选择

4．3 翻转肠囊实验装置改良

4．4 翻转肠囊内玉米miRNAs变化规律

4．5 玉米miRNAs在血浆中浓度及组织分布

5．结论

参考文献

致谢

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