猪腺病毒3型PCR检测方法的建立及Hexon基因克隆分析

摘要

猪腺病毒3型(Porcine adenovirus3，PADV-3)是猪腺病毒中最常见的一种血清型，主要引起猪群腹泻。1964年Haig首次从英格兰腹泻仔猪直肠拭子中分离到该病毒，随后在澳大利亚、美国、加拿大、西班牙、中国等国家相继被报道。目前，由于对PADV-3研究较少，在该病毒结构和功能、诊断方法、流行病学、致病性等方面均有待深入系统研究。
　　本研究根据GeenBank中登陆的PADV-3 E1B基因序列(登录号:AB026117)，利用Primer5.0软件设计两对特异性引物，预计扩增片段大小分别为247 bp和194bp。经条件优化，成功建立了针对PADV-3 PCR检测方法和荧光定量PCR检测方法，两种方法的特异性和重复性较好，且均具有较高灵敏度，分别最低可检3.7×105拷贝/μL和3.1×102拷贝/μL。应用本研究建立的常规PCR开展PADV-3感染情况调查，对从四川省部分地区收集的283份粪便样品进行检测。结果显示，PADV-3总阳性率为7.07％(20/283)，非腹泻猪群PADV-3阳性率为3.31％，腹泻猪群中PADV-3阳性率为9.87％，显著高于非腹泻猪群。应用所建实时荧光定量PCR开展PADV-3感染组织特性研究，对8头PADV-3感染阳性仔猪相应组织器官进行采样检测。结果显示，肠粘膜、肠系膜淋巴结、肺、扁桃体中PADV-3含量分别为2.24×104～6.42×105拷贝/mg、9.49×103～7.36×104拷贝/mg、5.59×103～1.65×105拷贝/mg和9.93×103～1.89×105拷贝/mg，病毒含量显著高于其它组织器官。
　　根据GenBank中PADV-3 Hexon基因序列（登录号:AC000189）设计两对引物。以阳性病料DNA为模板，分段扩增克隆，经测序分析，得到Hexon全基因序列（登录号:KU761583）。利用生物信息学软件对所获PADV-3 Hexon全基因进行分析。结果显示，所获Hexon全基因为2799 bp，编码932个氨基酸，理论分子质量为105653.8 u，理论等电点为5.23;该蛋白不稳定指数为42.92，属不稳定蛋白;且同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性。该蛋白最大疏水指数和最小疏水指数分别为2.289和-3.011，表现一定疏水性;氨基酸中无信号肽切割位点，推测该蛋白缺乏信号肽。Hexon蛋白含有25个丝氨酸、18个苏氨酸、21个络氨酸激酶磷酸化位点和35个抗原位点。将PADV-3克隆株（SCMS01株）与参考株的Hexon基因核苷酸序列进行同源性分析。结果显示，核苷酸同源性为87.8％～100％，表明PADV-3在各国之间流行不稳定。对SCMS01株和参考株Hexon基因构建系统进化树。结果显示，SCMS01株与德国株(PGOU244)在一个小分支上，两者亲缘性较高。

目录

声明

摘要

常用缩略词表

文献综述

1 病原学

1．1 腺病毒的分类

1．2 PADV-3基因组结构及特点

1．3 PADV-3 Hexon和E区基因的结构功能

1．4 PADV-3生物学特性

1．5 PADV-3病原流行

1．6 疫苗载体应用

2 检测方法研究应用

2．1 免疫电子显微镜

2．2 酶联免疫吸附试验

2．3 聚合酶链式反应

3 前景展望

4 研究的目的与意义

第一章 猪腺病毒3型PCR检测方法的建立

1 试验材料

1．1 阳性病料

1．2 临床样品的收集

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

1．5 溶液配制

2 试验方法

2．1 PADV-3 PCR检测方法的建立

2．2 PADV-3实时荧光定量PCR检测方法的建立

3 结果

3．1 PADV-3 PCR检测方法建立结果

3．2 PADV-3实时荧光定量PCR建立结果

4 讨论

4．1 PCR的检测方法

4．2 实时荧光定量PCR的检测方法

5 小结

第二章 Hexon基因克隆分析

1 试验材料

1．1 生物信息学软件

2 试验方法

2．1 引物的设计与合成

2．2 PADV-3 Hexon全基因克隆与测序

2．3 Hexon蛋白基本理化性质分析

2．4 Hexon基因密码子的偏嗜性分析

2．5 抗原表位预测分析

2．6 Hexon蛋白疏水性分析

2．7 Hexon蛋白信号肽分析

2．8 Hexon蛋白磷酸化位点分析

2．9 遗传变异分析

3 结果

3．1 Hexon基因克隆与鉴定

3．2 Hexon蛋白基本理化性质分析

3．3 Hexon基因密码子的偏嗜性分析

3．4 抗原表位预测分析

3．5 Hexon蛋白疏水性分析

3．6 Hexon蛋白信号肽分析

3．7 Hexon蛋白磷酸化位点分析

3．8 遗传变异分析

4 讨论

5 小结

全文结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文